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没有液氮罐如何冻存细胞呢?不用液氮罐,在冰箱如何冻存2~8度/-20度/-70度可以存放多久呢?
如果不用液氮罐,可以用-80度。我们是这样做的,将细胞转移至冻存管中,在-20放置半小时到一小时左右,预冻。之后放入-70中,我们尝试过载-70中放置1年的细胞没有问题,复苏之后状态尚佳。至于更长时间我们没有尝试过,但是老板说1年半没问题,在国外做实验的时候他使用过。
细胞冻存主要操作流程(供参考)
细胞冻存液推荐:DMSO(德国applichema3672)orBambanker细胞冻存液
1.选用对数生长期细胞,在收集细胞24小时前换液一次。
2.用常规方法将细胞消化下来,按(1-5)×106/ml浓度、悬浮于含有10%DMSO(applichema3672)的小牛血清或生长液中。冻存的细胞数量要充分,因复苏时接种的细胞数量应比平常多一些;
3.用吸管吸取细胞悬液,分装于无菌Eppendorf管中(每管1ml),严密封口,放入三层纱布小袋,注明细胞名称和冻存时间,便于以后查找。
4.从把安培悬液在液氮容器口开始计时,在30~40min内,下降到液氮表面,停留30min后,直接投入液氮中。或先将安培移入液氮罐口颈部气相中过夜,次日将纱布袋缓慢下降至液氮中,历时3分钟。在液氮中可长期保存。若没有液氮,可冻存于-80冰箱内,稳定保持一年以上。
细胞冻存遵循:慢冻速溶的原则。
除了常规的以上操作,还可以拿毛巾包着冻存管就可以直接放进-70,即可以遵循细胞冻慢冻速溶的原则,又比较方便,不用先放-20,因为是慢慢冻进去的,所以能更好的达到梯度冻存。保证了Bambanker细胞冻存液的高复苏率。
慢冻是要给DMSO(applichema3672)orBambanker细胞冻存液,以渗透入细胞的时间,所以我的经验是4度的半小时要保证,之后就基本上可以马上冻起来也没有什么关系了。
毛巾包裹法十分新颖,呵呵。不过,从原理上看,确实是值得尝试的好方法,既保证了时间,又省去了搬来搬去的麻烦。
至于-80度的保存时间,我亲眼所见,一年以上稳定保存。复苏效果尚佳。
在4度的情况下,要看你是什么细胞了,如果是老鼠的细胞可以放1小时左右,其他细胞最多半小时(本人做过试验的);在-20度的情况下,老鼠的可以放1天左右,其他细胞半天,但其状态不是很好了;在-70度的情况下,老鼠的细胞可以放1到2年,在此期间要复苏一次看其生长情况,其他细胞冻存约一年了!
不过现在也有一些即用型的冻存液,比较不错,不需要这么麻烦,悬浮好细胞以后直接加,也不用程序性降温,直接-80度冰箱就搞定了的,配方的话,应该不是传统的DMSO加血清,里面有些东西比较复杂,但也就是这配方保证了细胞冻存和复苏的效果,过一年以上复苏的话,复苏率还非常高,比传统的DMSO加血清要高很多,没法比,很给力。不过这东西国产的还没有做到这么高级,都是进口的,比较贵,比如日本的Bambanker。不过用量少,每管加1ml,整体来说花费也不多,但是节省了很多时间和精力,有这些精力可以集中起来看很多文献和做实验啦。现在国内的实验室用的倒不多,有钱的也用,主要是CRO企业和制药企业有大量的细胞冻存和反复复苏的,用这个非常适合,超级节省人力和时间,而且还保证了复苏率,对于那些难复苏的细胞,简直是福音啊。
A3672_en_GB.pdf(95.9k)
细胞冻存液.docx(122.32k)
如果不用液氮罐,可以用-80度。我们是这样做的,将细胞转移至冻存管中,在-20放置半小时到一小时左右,预冻。之后放入-70中,我们尝试过载-70中放置1年的细胞没有问题,复苏之后状态尚佳。至于更长时间我们没有尝试过,但是老板说1年半没问题,在国外做实验的时候他使用过。
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慢冻是要给DMSO(applichema3672)orBambanker细胞冻存液,以渗透入细胞的时间,所以我的经验是4度的半小时要保证,之后就基本上可以马上冻起来也没有什么关系了。
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不过现在也有一些即用型的冻存液,比较不错,不需要这么麻烦,悬浮好细胞以后直接加,也不用程序性降温,直接-80度冰箱就搞定了的,配方的话,应该不是传统的DMSO加血清,里面有些东西比较复杂,但也就是这配方保证了细胞冻存和复苏的效果,过一年以上复苏的话,复苏率还非常高,比传统的DMSO加血清要高很多,没法比,很给力。不过这东西国产的还没有做到这么高级,都是进口的,比较贵,比如日本的Bambanker。不过用量少,每管加1ml,整体来说花费也不多,但是节省了很多时间和精力,有这些精力可以集中起来看很多文献和做实验啦。现在国内的实验室用的倒不多,有钱的也用,主要是CRO企业和制药企业有大量的细胞冻存和反复复苏的,用这个非常适合,超级节省人力和时间,而且还保证了复苏率,对于那些难复苏的细胞,简直是福音啊。
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