2021-07-30【实验求助】没有液氮罐如何冻存细胞？

没有液氮罐如何冻存细胞呢？不用液氮罐，在冰箱如何冻存2~8度/-20度/-70度可以存放多久呢？
如果不用液氮罐，可以用-80度。我们是这样做的，将细胞转移至冻存管中，在-20放置半小时到一小时左右，预冻。之后放入-70中，我们尝试过载-70中放置1年的细胞没有问题，复苏之后状态尚佳。至于更长时间我们没有尝试过，但是老板说1年半没问题，在国外做实验的时候他使用过。

细胞冻存主要操作流程（供参考）
细胞冻存液推荐：DMSO（德国applichema3672）orBambanker细胞冻存液
1.选用对数生长期细胞，在收集细胞24小时前换液一次。
2.用常规方法将细胞消化下来，按（1-5）×106/ml浓度、悬浮于含有10%DMSO（applichema3672）的小牛血清或生长液中。冻存的细胞数量要充分，因复苏时接种的细胞数量应比平常多一些；
3.用吸管吸取细胞悬液，分装于无菌Eppendorf管中(每管1ml)，严密封口，放入三层纱布小袋，注明细胞名称和冻存时间，便于以后查找。
4.从把安培悬液在液氮容器口开始计时，在30～40min内，下降到液氮表面，停留30min后，直接投入液氮中。或先将安培移入液氮罐口颈部气相中过夜，次日将纱布袋缓慢下降至液氮中，历时3分钟。在液氮中可长期保存。若没有液氮，可冻存于-80冰箱内，稳定保持一年以上。

细胞冻存遵循：慢冻速溶的原则。

除了常规的以上操作，还可以拿毛巾包着冻存管就可以直接放进-70，即可以遵循细胞冻慢冻速溶的原则，又比较方便，不用先放-20，因为是慢慢冻进去的，所以能更好的达到梯度冻存。保证了Bambanker细胞冻存液的高复苏率。
慢冻是要给DMSO（applichema3672）orBambanker细胞冻存液，以渗透入细胞的时间，所以我的经验是4度的半小时要保证，之后就基本上可以马上冻起来也没有什么关系了。
毛巾包裹法十分新颖，呵呵。不过，从原理上看，确实是值得尝试的好方法，既保证了时间，又省去了搬来搬去的麻烦。
至于-80度的保存时间，我亲眼所见，一年以上稳定保存。复苏效果尚佳。
在4度的情况下，要看你是什么细胞了，如果是老鼠的细胞可以放1小时左右，其他细胞最多半小时（本人做过试验的）；在-20度的情况下，老鼠的可以放1天左右，其他细胞半天，但其状态不是很好了；在-70度的情况下，老鼠的细胞可以放１到2年，在此期间要复苏一次看其生长情况，其他细胞冻存约一年了！
不过现在也有一些即用型的冻存液，比较不错，不需要这么麻烦，悬浮好细胞以后直接加，也不用程序性降温，直接-80度冰箱就搞定了的，配方的话，应该不是传统的DMSO加血清，里面有些东西比较复杂，但也就是这配方保证了细胞冻存和复苏的效果，过一年以上复苏的话，复苏率还非常高，比传统的DMSO加血清要高很多，没法比，很给力。不过这东西国产的还没有做到这么高级，都是进口的，比较贵，比如日本的Bambanker。不过用量少，每管加1ml，整体来说花费也不多，但是节省了很多时间和精力，有这些精力可以集中起来看很多文献和做实验啦。现在国内的实验室用的倒不多，有钱的也用，主要是CRO企业和制药企业有大量的细胞冻存和反复复苏的，用这个非常适合，超级节省人力和时间，而且还保证了复苏率，对于那些难复苏的细胞，简直是福音啊。


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