第二章酵母双杂交筛选1.操作流程诱饵基因转化筛库宿主菌Y190——>含诱饵基因的Y190保种——>诱饵基因的自激活检测——>筛库(组织库或者小文库)——>挑选鉴定阳性克隆——>抽提阳性克隆中PREY质粒并在细菌中扩增——>猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共同转化Y190，验证其相互作用2.方法2.1诱饵基因转化筛库宿主菌Y1901）3个1mm克隆接种于3mlYPD液体培养基30℃振荡培养20小时(过夜)，OD600达到1.2左右。2）将此3ml菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD中培养4小时左右，使培养液OD600达到0.6。3）50ml离心管收集菌液(Falcon,BD)，EppendorfCentrifuge5810R,700g(1，865rpm)，5分钟离心收集菌体，弃上清。4）20mlddH2O重悬菌体，EppendorfCentrifuge5810R，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。5）20ml1XTE/LiAc*重悬菌体，EppendorfCentrifuge5810R，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。6）根据每个转化需要50μl菌液的量加入1XTE/LiAc重悬菌体，分装到Eppendorf管中，每管50μl菌液。7）每管加约100ngBait基因质粒，5μl预变性的CarrierDNA*，500μl1XTE/LiAc/PEG*。8）放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30分钟,15分钟时混匀一次。9）30分钟后，每管加入15μlDMSO(DIMETHYLSULFOXIDE)，轻轻上下颠第二章酵母双杂交筛选8倒混匀。10）42℃水浴热激20分钟，每10分钟上下颠倒混匀一次。11）冰浴5分钟。12）700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。13）ddH2O洗涤一次菌体。14）利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp平板上。15）30℃培养箱培养。第2天即可观察到克隆长出，第3天克隆即长到所需大小。CarrierDNA:HerringTestesCarrierDNA,Denatured.Clontech.10mg/ml.未使用过的CarrierDNA先100℃变性10分钟，立即置于冰浴2分钟,然后再100℃变性10分钟，之后置于冰浴上备用。已经使用过的CarrierDNA只需要100℃变性一次即可。1XTE/LiAc:V10XTE:V10XLiAc:VH2O=1:1:81XTE/LiAc/PEG:V10XTE:V10XLiAc:V50%PEG=1:1:850%PEG：50%为质量体积比。PEG3350溶于ddH20中一般需要加热溶解10XTE：0.1MTris-HCl,10mMEDTA,pH7.510XLiAc：1MLiAc,pH7.52.2含Bait基因质粒的Y190保种Bait基因长出克隆后，一般用诱饵基因特异性引物直接在酵母菌落中PCR鉴定是否转入正确的Bait基因的质粒，然后把经鉴定正确的克隆进行保种。2.2.1酵母菌落PCR1)用含Bait基因的质粒作为阳性对照，用宿主菌Y190作为阴性对照2)按照下列反应体系进行PCRExTaqPremix(Takara)10μl(2X)5’Primer0.5μl(10μM)3’Primer0.5μl(10μM)第二章酵母双杂交筛选9ddH208.9μl菌0.1μl3)按照下列反应条件进行PCR95℃5分钟94℃30秒58℃30秒72℃2分钟72℃5分钟72℃延伸2分钟是针对小于2Kb的Bait基因,对于长于2Kb的Bait基因要相应延长时间。4）PCR产物进行电泳检测2.2.2阳性克隆保种1）将阳性克隆接种到3ml相应液体培养基中，30℃振荡培养2-3天。2）700g,5分钟,离心收集菌体。3）加入1：1的液体培养基和SterileGlycerolSolution*混合溶液。4）充分悬浮菌体，放于-80℃保存。SterileGlycerolSolution:65%(V/V)glycerol,0.1MMgSO4,0.5mMTris-HCl,pH7.42.3Bait基因的自激活检测一般采用膜检的方法，检测LacZ基因的表达情况。膜检方法如下:1)将阳性克隆菌落影印于滤纸上。2)将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30秒，取出后晾干。3)培养皿加入适量显色液*(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm培养皿加2ml显色液，15cm培养皿加5ml显色液。4)盖上皿盖，放置在37℃培养箱中，避光放置。5)20分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3小时为准，特殊情况下可以看过夜是否变蓝。6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。35cycles第二章酵母双杂交筛选10显色液:100mlZbuffer,0.27mlβ–mercaptoethanol,1.67mlX-galZbuffer:16.1g/LNa2HPO4·7H20,5.50g/LNaH2PO4·H2O,0.75g/LKCl,0.246g/LMgSO4·7H2O,pH7.0。室温可以存放一年。X-gal:X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside)溶于DMF(N,N-dimethylformamide)中，终浓度为20mg/ml。2.4诱饵基因筛库2.4.1转化法筛选组织库1)5-10个2mm克隆接种于1mlSD/-Trp液体培养基中，混匀后转入150mlSD/-Trp振荡培养20小时(过夜)，至OD600=1.2左右。2)150ml培养液转入1000mlYPDA(YPD+Adenine)中混匀，此时OD600=0.2~0.3。3)培养约4~5小时至OD600>0.6。4)500ml离心管收集菌液。BeckmanCoulterCentrifugeAvantiJ-25(以下步骤均使用此离心机),700g,5分钟,RT(室温)。同时将2000μlCarrierDNA预变性两次。5)500mlddH2O洗涤一次，700g,5分钟,RT，收集菌体。6)30ml1XTE/LiAC洗涤菌体(预先配制50ml1XTE/LiAC),转入100ml离心管。7)700g,5分钟,RT。(预先配制50ml1XTE/LiAC/PEG)。8)加入12ml1XTE/LiAc重悬菌体。9)加入100~500μg文库DNA,2000μl预变性的CarrierDNA，轻轻混匀。10)加入50ml1XTE/LiAc/PEG,剧烈涡旋混匀。11)30℃孵育45分钟，每15分钟混匀一次.12)加入3.2mlDMSO,轻轻混匀.13)42℃热激20分钟,每10分钟混匀一次.14)冰浴5分钟.15）700g,5分钟，收集菌体.16）加入1000mlYPDA,30℃振荡培养60分钟.17）700g,5分钟，收集菌体.第二章酵母双杂交筛选1118)加入2ml0.9％NaCl悬浮菌体，终体积约5ml左右。取20μl菌液做滴度测定，其余菌液200μl/块，涂布于15cmSD/-Trp/-Leu/-His/+30mM3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。19)滴度(转库效率)测定：20μl+180μlNaCl(0.9％)1:10；20μl+180μlNaCl(0.9％)1:100；20μl+180μlNaCl(0.9％)1:1000；20μl+180μlNaCl(0.9％)1:1000020μl+180μlNaCl(0.9％)1:1000001:1000;1:10000；1:100000三种浓度各取100μl涂布SD/-Trp/-Leu平板20)转库效率的计算：对生长在SD/-Trp/-Leu平板上的克隆计数，挑选克隆数在30-300之间稀释度计算转库效率转库效率计算实例：..在1：10000转库效率计数平板上长出100个克隆(稀释度=0.0001)..总悬浮体积=5ml..文库质粒用量=100μg转库效率==5X105cfu/μg21)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT平板上生长7-14天后，会有阳性克隆生长出来，阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey质粒与Bait质粒做共转验证。2.4.2筛选小文库2.4.2.1转化法1)5~10个2mm克隆接种于2mlSD/-Trp液体培养基中，摇20小时(过夜)，至OD600=1.2左右。2)2ml培养液转入20mlYPDA中，此时OD600=0.2~0.3。克隆数(cfu)X总悬浮体积涂板体积X稀释度X文库用量(μg)=cfu/μgDNA100cfuX(5mlX103μl/ml)100μlX0.0001X100μg第二章酵母双杂交筛选123)培养约4~5小时至OD600>0.6。4)用50ml离心管收集菌液，EppendorfCentrifuge5810R(以下步骤均使用此离心机),700g,5分钟,RT。同时将CarrierDNA预变性两次。5)10mlddH2O洗涤一次，700g,5分钟,RT，收集菌体。6)10ml1XTE/LiAc洗涤菌体(预先配制1XTE/LiAc)700g,5分钟,RT。(预先配制1XTE/LiAC/PEG)。7)加入600μl1XTE/LiAc重悬菌体。8）加入2μg小文库DNA，20μl预变性CarrierDNA，轻轻混匀。9）加入2.5ml1XTE/LiAc/PEG,剧烈涡旋混匀。10)30℃孵育45分钟，每15分钟混匀一次。11)加入160μlDMSO,轻轻混匀。12)42℃，热激20分钟,每10分钟混匀一次。13)冰浴5分钟。14)700g,5分钟,收集菌体。15)加入20mlYPDA,30℃摇60分钟。16)700g,5分钟，收集菌体。17)加入200μl0.9％NaCl悬浮菌体,取20μl菌液做滴度测定，其余菌液涂布于一块15cmSD/-Trp/-Leu/-His/+30mM3-AT平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。18)滴度测定：方法同筛选组织文库。19)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT平板上生长7-14天后，会有阳性克隆生长出来。阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey质粒与Bait质粒做共转验证。2.4.2.2Mating法1)将带有小文库基因的质粒分别转入Y187中(方法见1)，保存甘油菌(方法见2.2)。将甘油菌扩增并保存到96孔板(CorningIncorporatedcostar3599)中，每个孔对应一条小文库基因，-80℃冻存备用。2)将Y190菌液(携带pGB-诱饵基因质粒)平铺在15cm培养皿中,用96孔第二章酵母双杂交筛选13replicator(sigma)影印到15cmSD/-Trp平板上。将Y187菌(携带pACT2-小文库基因质粒)用96孔replicator从96孔板中影印到15cmSD/-Leu平板上。3)生长48-72小时，观察菌落生长情况，每个菌落长至3-5mm，分别印至绒布上。再从绒布上影印到15cm2xYPD平板上。Y190菌(携带PGB-X诱饵质粒)的96个克隆和Y187菌(携带pACT2-小文库基因质粒)的96个克隆一一对齐，影印到一起，使其发生Mating。30℃培养20~24小时。4)Mating完成，再用绒布把菌落从2xYPD平板影印至SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT平板上。5)30℃培养5~14天，在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT平板生长出来的克隆做膜检(方法见3)。6)对膜检显蓝色的菌落做PCR鉴定(方法见2.1)是否为对应的小文库基因，并用此基因的prey质粒与Bait质粒做共转验证。2.4.3注意事项1)2XYPD平板培养基应该稍微薄一些，这样培养基比较透明容易观察，可以尽量保证Y190菌和Y187菌克隆对齐。2)因为Y190为Adenine缺陷菌株，所以菌落为红色。而Y187非Adenine缺陷菌株。所以菌落为白色。为了便于操作，一般先把Y187菌影印到2XYPD平板，然后再影印Y190菌。3)Mating时应该设置阳性对照，以便监测Mating情况是否良好。2．5．抽提酵母质粒1）膜检变蓝的阳性克隆用牙签涂布在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT平板上，约2cm2，然后放置于30℃培养箱中培养3~4天。2)取一Eppendorf管，加入30μl5u/μlLyticase。把菌用牙签刮到lyticase中，Vortex充分悬浮。37℃孵育30分钟。3)加入170μlLysisBuffer使终体积为200μl。再加入200μl玻璃珠(425-600microns)，200μl酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，vortex剧烈振荡5分钟。第二章酵母双杂交筛选144)12,000rpm离心10分钟，将上清转入一干净Eppfendorf管中。注意，不要把蛋白转移过去。5)加入8μl10MNH4Ac和500μl无水乙醇，混匀，-80℃放置1小时。6)12,000rpm离心10分钟，去上清。7)加入500μl70%乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5分钟。8)弃上清，真空抽干沉淀。9)将沉淀重悬于10μlddH2O中，一般取2~3μl转化大肠杆菌。Lyticase:将Lyticase干粉溶解在1XTE中，终浓度为5u/μl。LysisBuffer:50mMTris-HCl(pH8.0),0.1%TritonX-100,0.5%SDS2.6酵母质粒的扩增一般用电转的方法，把从筛库所得的阳性克隆中抽提的Prey质粒在大肠杆菌中扩增。2.6.1大肠杆菌电转感受态制备1)挑一单克隆接入3mlLB培养基，摇培14~16小时至OD600=1.0~1.22)将摇培后的菌液转接1LLB培养基,摇培4~5小时至OD600=0.7-0.83)离心收菌，10ml冰水溶解4)5000g，2oC离心10分钟收菌，400ml冰水将菌重悬，冰浴10分钟5)5000g，2oC离心10分钟收菌，40ml预冷10%甘油重悬，冰浴10分钟6)5000g，2oC离心10分钟收菌，加1ml10%甘油重悬7)用枪测量重悬后的菌液体积，加入与菌液等体积的10%甘油(注：等体积10%甘油指重悬后的菌液体积减去1ml。例：加入1ml10%甘油后重悬菌液体积为4ml，则加入10%甘油量为3ml)8)分装到Eppendorf管中，每管100μl，冰上操作。9)-80oC冰箱保存。第二章酵母双杂交筛选1510)取出两管做阴性、阳性对照。LB：10g/L蛋白冻,10g/LNaCl；5g/L酵母提取物。121oC，20分钟灭菌。10%甘油：V甘油：V水=1：9。2.6.2电转1)从-80oC冰箱取出感受态，至冰上溶解。同时，将电转杯至冰上冷却，打开电转仪准备30分钟。2)感受态溶解后，将要转化的质粒(或连接产物或其他要转化的物质)加入感受态，用枪吹打均匀(注意，不要产生气泡)。电转时有必要进行阴性对照、阳性对照，以检验感受态是否被污染及感受态是否正常，有利于在出现问题时寻找原因。3)将混合后的感受态加入预冷的电转杯(Eppendorf,CAT.No.4307000569)。(注意，不要产生气泡)4)擦干电转杯上电极两边的壁。5)将电转杯放入电转仪，启动电极。6)电击后，用1mlSOC*将感受态洗出，37oC孵育45分钟。7)6,000rpm，3分钟离心收菌。8)涂板。不同电转杯的最适电压各不相同，经实验：1mm电转杯的最适电压为1900-2200V4mm电转杯的最适电压为2300-2500V8mm电转杯的最适电压为2500-2700VSOC:20g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.5g/LNaCl，2.5mMKCl，pH7.0。121oC，20分钟灭菌。冷却至60oC以下时，每升加入20ml灭菌的1M葡萄糖溶液。该溶液使用前每升加入5ml灭菌的2MMgCl2。2.7Prey质粒与Bait质粒共转Y190(参考1)1)3个1mm克隆接种于3mlYPD液体培养基30℃振荡培养20小时(过夜)，第二章酵母双杂交筛选16OD600达到1.2左右。2)将这3ml菌液接入大体积(体积视转化个数确定)YPD中培养4小时左右，使培养液OD600>0.6。3)50ml离心管收集菌液，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。4)20mlddH2O重悬菌体，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。5)20ml1XTE/LiAc重悬菌体，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。6)根据每个转化需要50μl菌液的量加入1XTE/LiAc重悬菌体，分装到Eppendorf管中，每管加50μl菌液。7)Prey质粒分别与Bait质粒和pGB质粒(无Bait基因)共转，每种质粒都加入约300ng；另外再加入5μl预变性的CarrierDNA，500μl1XTE/LiAc/PEG。8)放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30分钟,15分钟时混匀一次。9)每管加入15μlDMSO，轻轻上下颠倒混匀10)42℃水浴热激20分钟，每10分钟上下颠倒混匀一次。11)冰浴5分钟。12)700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。13)ddH2O洗涤一次菌体。14)利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp/-Leu平板上。15)30℃培养箱培养。第2天即可观察到克隆长出，第3天克隆即长到所需大小。16)用滤纸印大约十几个克隆进行膜检(方法见3)。

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