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培养细胞标记和裂解物的制备实验一温和去污裂解法
mayitao
/发布时间:1628357402 /浏览量:155
| 实验材料 | 培养细胞 试剂、试剂盒 | DMEMHClTBSTris 仪器、耗材 | 微量离心管Plexiglas盒吸头细胞刮子冷冻离心机
实验步骤 | 1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。 对于贴壁细胞： 3a. 加入预热的标记培养液，加入量为：0.5~1ml/35mm培养皿，1~2ml/50mm培养皿，或2~4ml/100mm培养皿。 对于非贴壁细胞： 2b. 1800g离心1min，吸去培养上清，细胞用含血清不加标记物的标记培养液重悬，再次离心吸去堉养液。 6. 标记结束时，将装有标记细胞的Plexiglas盒移至冷室，放在Plexiglas挡板后面。 对于贴壁细胞： 7a. 从Plexiglas盒子中取出培养皿，用一次性的移液管吸尽标记培养液，培养液和吸头或吸管均作为同位素废物弃置。 8a. 用2~10ml冷TBS洗涤细胞2次，同步骤7吸尽并弃去放射性废物。 对于非贴壁细胞： 7b. 从Plexiglas盒子中取出培养皿，将细胞移至带螺口盖的微量离心管中，1800g离心1min，回收细抱，吸尽培养液。 8b. 细胞用小体积的冷TBS重悬，移至带螺口盖微量离心管中，1800g离心1min，吸尽TBS。 9b. 毎107细胞用0.5~1ml适当的裂解缓冲液悬浮细胞，用一次性的巴斯德吸管轻轻混匀，4℃放置20min。 10. 盖上管盖，于4℃26000g离心30min澄清裂解液。 11. 离心后，将上清（裂解物）移至新的离心管中，离心管和沉淀作为同位素污物处理。 12. 用凝胶电泳，免疫沉淀或蛋白质纯化方法，分析标记的裂解液，所有过程均在4℃适当屏蔽下进行。
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