第三节微生物的分离经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。例如同样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌，有的是细菌，有的是霉菌，有的是芽孢杆菌，有的不产芽孢，有的生产能力强，有的生产能力弱等等。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。一、好气微生物的分离分离的方法很多，大体可分为两类：一类较为粗放，只能达到“菌落纯”，如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等。前两种方法由于操作简便有效，工业生产中应用较多。组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。另一类是较细的单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”或“细胞纯”的水平。这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操作装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离。下面对这几种分离纯化方法分别加以介绍。（一）稀释涂布法把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等，样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。（二）划线分离法用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。在样品含菌量较少或某种目的微生物不多的情况下，微生物的纯种分离方法可以简化如下：第一种方法，取一支盛有3～5ml无菌水的粗试管或小三角瓶，取混匀的样品少许（0.5g左右）放入其中，充分振荡分散，用灭菌滴管取一滴土壤悬液于琼脂平板上涂抹培养，或者用接种环接一环于平板上划线培养。这种方法不需要菌落计数，比以上常规稀释法简便。第二种方法，取风干粉末状的土样少许（几十毫克）直接洒在选择性分离培养基平板上或混入培养基中制成平板，置适温培养一定时间，长出菌落。例如分离小单孢菌就可采用该方法，从河泥中取样，风干研碎，取样品粉末20～50mg直接加到天门冬酰胺培养基中，混合均匀制成平板，培养后长出鱼卵状菌落。这种方法有时分离不够充分，可用划线法进一步纯化。（三）利用平皿的生化反应进行分离这是一种利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。1.透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。如要分离该酸水解酶产生菌，可用双层平板法，首先在普通平板培养基上把悬浮液涂抹培养，等长出菌落后覆盖一层营养琼脂，内含3%酵母RNA，0.7%琼脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，于42℃左右培养2～4h,四周产生透明圈的菌落，即为核酸分解酶产生菌。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。分离乳酸产生菌时，由于乳酸是一种较强的有机酸，因此，在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用，还有酸中和作用。2.变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2～7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。在进行解脂微生物的分离时，虽然有很多精确的测定方法，如酸碱滴定法、电位滴定法、浊度滴定法、甘油滴定法及色谱分析法等，但由于步骤繁琐，不适于大规模筛选测定。为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色圈法，如以吐温为底物，尼罗蓝（Nileblue）作为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。最常使用的方法是把恶秦染料中的维多利亚蓝和脂类底物混合，制成维多利亚蓝乳脂琼脂培养基平板，起始培养基调为中性，当土壤样品的悬浊液分离在平板上，具有脂解能力的菌落产生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，阳性解脂反应能显示粉红到蓝色的变化。如培养基起始pH为碱性，则阳性解脂反应从咖啡色到蓝绿色，能使脂类底物和解脂后的脂肪酸区别开来。后来又由Fryer等研究出一种改良的双层法，先在平皿内倒一层营养琼脂，把一张棉纸圆片在被维多利亚蓝染了色的乳脂中浸湿，铺在已凝固的琼脂表面，然后覆盖一薄层含样品的营养琼脂，保温培养，解脂菌落就可以在棉纸中产生蓝带。分解解脂细菌的培养基（％）为：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、琼脂2.0、大豆油5.0、维多利亚蓝4mg。分离内肽酶产生菌，除了用酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别外，还可以用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基中，产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据呈色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落。培养基平板由两层组成，底层含明胶1.2％，酵母汁0.1％，蛋白胨0.4％，琼脂1.5％，待凝固后在其上覆盖一层琼脂，琼脂含量为0.7％，由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氢钾缓冲液配制，配制浓度为0.083mol/L的吲羟乙酸酯溶液，取其中的0.3ml加入到上层琼脂中倒平板。通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙醇的菌株。在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。3.生长圈法生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时，都可采用生长圈法，工具菌用相应的营养缺陷型菌株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈。4.抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。通常抗生素的筛选要投入极大的人力、财力和时间。据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的生产菌。因此设计一个准确、迅速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已经得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。在青霉素菌种选育中，还可利用加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株，做法如下：将产黄青霉孢子进行诱变处理，致死率约为99％。分离于琼脂平板上，控制孢子浓度，使长成独立菌落，一直培养到青霉素产量达到顶峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鉴定菌枯草芽孢杆菌悬浮液中，铺张于菌落平板表面，凝固后，培养17～20h。测量抑菌圈大小，根据有效指标（抑菌圈直径于菌落直径之比）选出高产突变株。由于现有抗生素种类多样，得到新的抗生素越来越困难。人们除了从一些特殊的地方如极端环境中采样分离抗生素的产生菌，也采用一些特殊的筛选方法，以期从普通土样中分离筛选倒新的微生物及新的抗生素。除上述的抑菌圈外，稀释法、扩散法、生物自显影法等也不同程度的得到应用。在这些方法中，检验菌的选择十分重要，直接关系到检出的灵敏度和筛选到的抗生素的活性和抗菌谱。如在筛选抗细菌抗生素时，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为检验菌来检验抗生素的抗性。采用联合检验菌，如枯草杆菌和绿色产色链霉菌活巴氏梭菌，可分离出抗菌活性低、对其他试验菌活性高的新抗生素，如黄色霉素族的抗生素，而这些抗生素在单独使用枯草杆菌时无法检出。海洋是新抗生素的重要来源。许多海洋生物体内都含有微生物，这些微生物为宿主抵御病害起着关键作用。因此，从鱼组织和虾消化道里分离筛选抗癌药物和抗炎症药物是一个有效地途径。已从水母体内筛到一种名为salinamide的抗生素，一种抗真菌抗生素istatin也从海洋生物体中分离出。在筛选抗霉菌抗生素时，需根据其特点进行筛选，因霉菌与哺乳动物细胞性质相似，为减少药物对人体的副作用，需挑选对霉菌有抗性但对人体安全的抗生素。由于哺乳动物不含几丁质，因此可先筛选抑制几丁质合成酶的生理活性物质，再从中筛选所需抗生素。三国霉素和多氧菌素就是通过该方法筛选得到的。抗病毒抗生素及抗肿瘤药物的筛选则可通过敏感细菌培养平板的噬菌斑来判断。采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，而且还能筛选某些酶类。四）组织分离法组织分离法是由一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。如从患恶苗病的水稻组织中分离赤霉素，从根瘤中分离根瘤菌及从各种食用菌的子实体中分离孢子等。1.对一般有病组织的分离方法切除小块含菌组织，用干净水洗去组织表面污物。以10％漂白粉或0.1％升汞浸泡2～5分钟进行表面消毒，无菌水冲洗。将消毒后的组织移到平皿培养基上，置于适宜温度（25～26℃）培养一定时间，即可在组织周围四÷长出微生物。用肉眼或显微镜观察菌落，基本确认后挑入斜面培养基中培养。由这种方法挑选的菌株往往不纯，必须在琼脂平板上再分离纯化，然后挑取单个菌落于斜面，进一步筛选。从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌：取新鲜健壮的根瘤，经漂白粉或升汞溶液等进行表面消毒后，用无菌镊子将根瘤压破，取出汁液少许与分离培养基混合倒入平皿中，摊平，培养后在平板上长出菌落，经镜检观察后确认典型菌落，移入斜面。2.食用菌孢子分离法食用菌的孢子分离法通常有两种，即多孢子分离和单孢子分离。多孢子分离有混杂现象，不易筛选到优良稳定的菌株。因此，从育种角度最好采用单孢子分离。两种方法的分离步骤、方法介绍如下：（1）多孢子分离法取产量高、朵大、健壮无病并即将成熟的初生和单生子实体，用清水洗净表面污物，对子实体外有膜保护着的菇类，如蘑菇、草菇，在0.1%～0.2%升汞溶液浸泡2～3min，用无菌水冲洗数次。对子实体无膜外露的平菇等，不适于用升汞溶液浸泡，要用75%的酒精进行表面消毒，再用无菌水冲洗。食用菌的孢子着生在子实体的腹面的菌褶上，成熟时会自动弹出来。孢子采集装置：用一条两端弯成钩的铁丝，一端钩着一块成熟的蚕豆大子实体，另一端挂在三角瓶的瓶口上。三角瓶内事先制备好马铃薯—蔗糖培养基平板。悬挂的子实体距离培养基平板2～3cm。适温培养1～2天，就有孢子陆续弹落于三角瓶底部的培养基上，经过4～5天，孢子萌芽成菌丝，及时将菌丝尖端接入到斜面培养基上培养，然后进行生产性能对比试验。（2）单孢子分离法取一条铁丝，弯曲成蚊香支架形状，放在已消毒的玻璃板上。将消毒后的子实体悬挂在支架上方，下方置一个已灭菌的去盖的培养皿，然后罩一个钟罩，周围缝隙用凡士林封好。将这套孢子收集器移到恒温室内培养1～2天，将有大量孢子弹到平皿上，收集孢子（图6.2）。以上操作全部在超净台或无菌室内进行。将收集到的孢子用稀释法在马铃薯—蔗糖培养基平板上进行单孢子分离，培养后把单孢子长出的菌落移接到斜面上，进行生产性能比较试验。（五）单细胞或单孢子分离法采用特殊的仪器设备进行单细胞或单孢子的分离。具体方法有多种，现主要介绍柠檬酸产生菌采用的小滴分离纯化方法。操作如下：将待纯化的孢子悬液稀释约为1500ml-1，用校正口径的滴管（每毫升400滴）吸取孢子并均匀滴于无菌干燥盖玻片上，将其小心翻转于凹玻片的孔穴上，穴内加一滴已灭菌的培养液，盖玻片和载玻片用凡士林密封。显微镜下观察每个小滴，将只有一个孢子的小滴位置作好记录，恒温培养，挑取单菌落于斜面。除用凹玻片，还可用滤纸进行单细胞或单孢子分离。具体作法如下：取与皿内径大小一致的滤纸3～4层，浸在培养液中，取出放在空皿内，在滤纸上滴几滴甘油以防干燥，盖好皿盖，灭菌。将稀释为1500ml-1的孢子悬液用上述滴管滴在滤纸上，每皿约点20点滴左右，经恒温培养，每滴约出现10个菌落，将单菌落移接于斜面上。该方法能够得到单细胞或单孢子，较为精确，但操作时要细，否则不易得到理想结果。（六）特殊菌类——环保降解菌的分离自然界存在着大量废物及污染物，如多环芳烃（PAHs）、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和卤代烃等。在分离筛选这类物质的降解微生物由于该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养。不能利用该物质的微生物由于得不到营养被淘汰，能分解该物质的微生物则正常生长。经过几个月的连续培养后，将富集培养液划线或涂布于分离平板上，便能筛选到所需的环保降解菌株。分离平板可采用该污染物为底物的鉴别培养基，通过水解圈变色圈进一步提高筛选效率。采用该方法分离苯胺、DDT、甲基对硫磷（MP）石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果。如王倩如等人从经甲胺磷农药废水长期驯化的活性污泥中，筛选到能高效降解甲胺磷农药的蜡状芽孢杆菌（Bacilluscrerus）和嗜中温假单孢菌（Pseudomonasmesophilica），两株混合菌对有机磷的去除率达99.7%。在筛选环保降解菌时需注意，某些有毒污染物由于本身对微生物的生长有抑制作用，如果直接在培养基中加入该物质连续富集培养，可能效果不佳。这时就需根据不同的情况设计更合理的筛选模型。如Harris在分离以氯化物为氮源的细菌时，把浸透了KCN溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生的HCN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每天用新制备的浸湿KCN的滤纸更换，培养一段时间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易得到分解氰化物的菌株。由于塑料工业的发展，环境中到处都有各种高分子包装废弃物，这些污染物多为不溶于水的高分子化合物，获得其降解菌株较为困难。通常采用富集法进行筛选，如日本的小野胜道教授以低浓度聚乙烯作为富集培养基对土壤微生物进行驯化，分离到了三种能降解聚乙烯的细菌。在淀粉塑料的降解试验中，采用加富土壤淹埋法，筛选到的降解微生物主要是霉菌与放线菌。这可能是因为丝状体更容易深入共混物内部生长。尤其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均匀，由于聚乙烯的流动性好，因而在吹塑过程中膜表面的聚乙烯含量偏高，使细菌在初期很难降解这类共混物，所以在降解菌的研究方面应着重考虑霉菌与放线菌。除驯化培养进行降解菌的筛选外，还可采用阶段式筛选法。如在分离聚乙二醇降解菌时，可先筛选能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇的微生物，再从中筛选能降解聚乙二醇的菌株，也能达到较好的效果。除寻找能够降解废旧塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代现有塑料。目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纤维素类生物降解塑料等。有些生物降解塑料是以简单的物理共混工艺，将淀粉填充到聚乙烯等树脂内，淀粉可以被微生物分解，但树脂分子骨架在很长时间内仍分解不了，反而为废弃塑料的回收增加了困难。而一些聚脂类高分子由于具有和微生物本身可合成的聚β-羟基丁酯（PHB）相类似的结构，无毒，且能在酸、碱和微生物条件下完全降解，同时具有良好的塑性，用途宽广的多。用微生物发酵法生产的聚β-羟基脂肪酸（polyhydroxyalkanoicacid,PHAs）也成为研究生物降解塑料的热点，其中利用真氧产碱杆菌（Alcaligtneseutrophus）合成PHB的研究最多。另外，还有固氮菌（Azotobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）、生丝微菌（HyphomicrobiumX）、菌宿根瘤菌（Rhizobiummeliloti）、嗜盐杆菌（Halobacteria）等。目前人们已经克隆到PHAs合成途径的关键酶基因，包括：phbA(β酮硫裂解酶基因)、phbB(依赖NADPH的乙酰CoA还原基因)、phbC（PHB合成酶基因）。许多实验室已在进行酶基因导入E.coli的工作，期望利用E.coli大批量合成PHB。总之，利用廉价碳源的高产菌株的发现与选育是降解塑料领域中最有意义的研究之一。

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