PKC活性检测实验相关交流-蚂蚁淘在线

提供商：	晶莱生物
服务名称：	PKC活性检测实验
规格：	实验服务

实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司，V5330）
实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）
基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。

操作步骤：
1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000×g离心裂解液5分钟，保存上清。
3．用PKC抽提液预平衡1ml的DEAE纤维素柱，再把第2步中得到的上清过柱。用5ml的PKC抽提液洗柱子，然后用5ml含有200mMNaCl的PKC抽提液洗脱含有PKC的组分。
4．用PKC稀释液（PKCdilutionbuffer）将少量蛋白激酶C（PromteinKinaseC）稀释到2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKCActivatorSolution20-30秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml小离心管中混合PepTag®PKC5×Buffer,PepTag®C1Peptide，超声过的PKCActivator5XSolution，和水。在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。

标准PKC检测
PepTag®PKCReaction5XBuffer                       5ul
PepTag®C1Peptide(0.4ug/ul)                        5ul
PKCActivator5XSolution,超声处理的                 5ul
短肽保护液（非必须）                                  1ul
样品                                                 9ul
去离子水使终体积为                                    25ul

PKC阳性对照检测
PepTag®PKCReaction5XBuffer                       5ul
PepTag®C1Peptide(0.4ug/ul)                        5ul
PKCActivator5XSolution,超声处理的                  5ul
短肽保护液（非必须）                                   1ul
ProteinKinaseC(2.5ug/ml溶于PKCdilutionbuffer）  4ul
去离子水使终体积为                                    25ul

PKC阴性对照检测（不加PKC）
PepTag®PKCReaction5XBuffer                       5ul
PepTag®C1Peptide(0.4ug/ul)                         5ul
PKCActivator5XSolution,超声处理的                   5ul
短肽保护液（非必须）                                   1ul#p#分页标题#e#
去离子水使终体积为                                     25ul

7．在0时间点，把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2分钟。然后加入样品或蛋白激酶C在30℃再孵育30分钟。
8．把管子放进开水浴或95℃加热块10分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃或-20℃。
9．把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul的80％甘油，以确保样品保留在上样孔中（说明书第III.F部分）。
10．每孔点样10ul，在0.8%琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。

检测结果：
说明：后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。
注：阳性条带以Gelpro4版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integratedopticaldensity）累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比
（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+p-PKC总和为100分配IOD数值）

Lanes:	Lane1	Lane2	Lane3	Lane4	Lane5	Lane6	LanePC
Rows	(%)	(%)	(%)	(%)	(%)	(%)	(%)
PKC	77.082	75.616	88.98	66.975	77.93	74.645	100
p-PKC	22.918	24.384	11.02	33.025	22.07	25.355	0
Sum	100	100	100	100	100	100	100
p-PKC:PKC	0.29732	0.322471	0.123848	0.493094	0.283203	0.339674	0
样本	#1	#2	#3	#4	#5	#6	PC

收费标准/服务周期/提供结果：
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