二抗 – 优化您的检测系统On This Page实验设计 – 方法- 参考指南主要提示抗体一览产品二抗和试剂交叉吸附二抗如何使用二抗 - 常见问题tometry二抗CH2 和 CH3 结构域二抗结合位置二抗方案和资源二抗选择工具在流式细胞术中自信地使用二抗

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二抗 - 优化您的检测系统

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二抗用于检测已与靶抗原结合的未偶联的一抗。

与酶和荧光团偶联的二抗是检测的关键组成部分n 系统和最佳二抗的选择除了减少假阳性或阴性染色外还可以改善阳性信号。

可通过添加与二抗结合的标记三抗来进一步放大检测信号。

二抗选择工具方案和资源

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实验设计 – 操作方法参考指南

实验设计是获得精确结果的关键步骤。为确保成功，重要的是要考虑：

1二抗的克隆性

多克隆抗体——通常在山羊、兔子、绵羊或驴中产生的抗体群，可识别许多不同的表位 o在他们产生的抗体中。然后信号被放大，因为多个二级抗体与相同的一级抗体结合

单克隆抗体——这些抗体通常在小鼠或大鼠中产生。它们识别它们所针对的抗体上的单个表位，因此它们不会放大信号

2二抗的靶标

类别 — IgG、IgA、IgD、IgE 和 IgM

同种型——例如，针对小鼠 IgG 的多克隆二抗将偏向于与最常见的同种型（在本例中为 IgG1）发生反应。为了获得更稀有的同种型（例如 IgG2b）的更强信号，选择专门针对该同种型产生的二级可能是有利的。示例同种型是 IgG1、IgG2a、IgG2b

链——虽然一抗的哪些部分是二抗的表位通常并不重要，但可以选择针对特定区域产生的二抗重链或 ag如果这是必要的，则不要轻链

重链，例如，Fc 域或铰链区

轻链，例如，kappa 或 lambda

结合位置 – 它是重要的是要考虑您希望二抗结合在一抗上的什么位置。在二抗结合位点综述中，我们重点介绍了结合位点的不同选择、它们的优势及其应用示例

3二抗宿主

理想情况下，二抗应来自系统发育上远离的宿主物种一抗的目标物种。这将最大限度地减少二抗通过 Fc 受体与目标组织或细胞的直接结合，否则 Fc 阻断会减少这种结合。

4目标物种

在本文中，它被定义为您的一抗的宿主物种.请注意，一些密切相关的物种具有抗原性非常相似的抗体，可以加以利用，例如抗山羊 IgG 抗体 will常与绵羊抗体发生交叉反应。

5交叉吸附抗体

交叉反应常见于二抗。例如，抗小鼠 IgG 可能与大鼠 IgG 在某种程度上发生交叉反应，或者抗大鼠 IgG 可能与 IgM 发生交叉反应，而抗小鼠 IgG2a 与小鼠 IgG2b 可能发生交叉反应。在许多情况下，这些问题并不显着，但在其他情况下，需要高度的特异性才能获得准确的数据

此处建议使用交叉吸附二抗。通过预吸附二抗与交叉反应抗原，去除不需要的交叉反应，从而产生更具特异性的二抗，从而减少非特异性背景染色。

阅读我们对交叉吸附二抗的概述了解为什么以及如何使用它们，它们是如何产生的，以及现在可用的交叉吸附二抗列表。

6Controls

包括一个仅用于二抗的对照，以确保没有非特异性染色来自

7检测试剂

检测试剂的选择将取决于应用和特定实验的具体情况。

ELISA — 酶联二抗是最受欢迎的选择< /p>

流式细胞术 — 选择与荧光团偶联的二抗

细胞或组织染色 — HRP、碱性磷酸酶或荧光连接的二抗

Western blotting — 酶-连接和荧光标记的二抗是最好的

示例检测试剂：

荧光染料，例如 PE 和 FITC

化学发光，例如，HRP

比色法，例如碱性磷酸酶

结合链霉亲和素——与生物素标记的一抗一起使用

8应用

这是实验设计的关键组成部分，将影响许多选择用于二抗选择。请参阅此处的抗体选择分步流程图。

间接染色 w可能需要仔细优化您的实验，以避免非特异性结合。为帮助解决这个问题，Bio-Rad 创建了一个操作指南，以便您可以使用二抗检测试剂实现最佳特异性流式染色。

9使用二抗多重检测未偶联的一抗

多重差异标记的一抗不是总是可能的，但通过仔细选择未偶联的一抗和选定的二抗，它是可以实现的。需要考虑三个主要因素：不同的物种、类别和同种型。

单击此处了解有关使用二抗进行多重分析的更多信息。

阅读我们对多重荧光蛋白质印迹的概述以了解优势。

10HuCAL®生成抗体的二抗检测

人类组合抗体库（HuCAL）生成的重组抗体，用于定制开发新的抗体特异性，可用于广泛的ra免疫测定法的 nge，例如蛋白质印迹法、免疫组织化学、ELISA 和流式细胞术。各种特异性的抗人和抗标签二抗是检测这些抗体的理想选择；有关完整详细信息，请下载我们关于支持 HuCAL 分析开发的试剂资源。

提示

当使用多种二抗时，确保它们不会发生交叉反应

当处理一些含有大量 Fc 受体的免疫组织或细胞时，它有助于选择 F(ab) 或 F(ab\')2 片段以消除非特异性结合。或者，使用来自二抗宿主物种的纯化 IgG 或来自靶细胞的血清，通过吸收步骤阻断 Fc 受体

使用二抗时查看我们的 IHC 提示

任何问题？让我们帮忙，联系我们的技术人员cal support teamfor advice

二抗一览

二抗试剂经过精心挑选，可提供最佳质量和灵活性：

单克隆或多克隆

IgG 分子和F(ab\')2 片段

提供多种形式

广泛的应用，包括 - 流式细胞术、免疫细胞化学和蛋白质印迹

交叉吸收抗体< /p>

StarBrightrange 产品。它们是荧光的、亲和纯化的，并针对特异性和滴度进行了仔细优化

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目标

宿主

类和链

偶联物

人

小鼠

大鼠

山羊

兔

羊

牛

豚鼠

猫

鸡

< p>猴

鱼

狗

仓鼠

马

猪

驴

兔

山羊

小鼠

绵羊

大鼠

人< /p>

Ig

IgA, IgA A1, IgA A2, IgA H, IgA 分泌链

IgD, IgD H, IgD D

IgE

IgG、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4、IgG H/L、IgG Fc、IgG Fc CH2 结构域、IgG CH2 结构域、IgG CH3结构域，IgG γ，IgG Fab，IgG F(ab\')2

IgM，IgM Mu，IgM H

IgG/A/M

Lamba light链

Kappa轻链

J链

纯化

血清

S/N

FITC

Tric

HRP

生物素

碱性磷酸酶

德克萨斯红

星亮蓝

DyLight 405

DyLight 488

DyLight 549

DyLight 649

DyLight 680

DyLight 800

Bgal

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