客户单位：中国科学院生物物理所范祖森课题组
中康博提供：AffymetrixmRNA+LncRNA二合一芯片检测 （筛选差异mRNA和lncRNA）
高通量生物信息分析（聚类分析、功能富集分析、KEGG信号通路富集分析、网络分析）
lncRNA涉及到各种生物过程，包括转录调控，印迹，染色质修饰和核转运等。由临近编码基因相反方向转录的lncRNA占哺乳动物中lncRNA总数的20％左右。研究报告称，这些调控临近编码基因的lncRNA（反向性lncRNA）多对中胚层分化和心脏发育上发挥关键作用，然而，这类lncRNA的生物学作用在免疫系统上基本上是未知的。中国科学院生物物理所的范祖森研究员带领的研究小组于2017年5月20日在国际学术期刊《Nature immunology》上在线发表了一项名为 Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3maintenance by initiation of Zfp292 expression 的最新研究论文，首次报告了他们在ILC3s中发现lncKdm2b的高表达，并且这一效应在ILC3s的维持和功能上起到了关键作用。
研究背景
近来已将ILC定义为自然免疫系统的一部分。ILCs存在于粘膜表面，可促进免疫应答、维持粘膜完整性，促进淋巴组织发生。根据效应细胞因子，ILC可以分为三种：ILC1s、ILC2s 和ILC3s。其中有研究表明ILC3可能受转录因子控制，但如何调控或维护ILC3发生的机制仍然不清楚。LncRNA是长于200nt的缺乏蛋白质编码潜能的核苷酸，比编码基因更具组织特异性和细胞型特异性，这表明它们在生理和病理上具有明显的生物学作用。然而lncRNA在免疫系统上的生物学作用基本上是未知的。在这里研究了lncRNA lncKdm2b在ILC3s中高表达，是维持ILC3s所必需的。
研究结果
1、LncKdm2b缺失影响ILC3维持作用研究识别出一个胚胎干细胞多能性维持所需的非特异性lncRNA，并命名为lncKdm2b（由Kdm2b基因剪切产生）。 LncKdm2b缺失后胚胎在第3天（E3.0）囊胚发育停滞，导致早期胚胎死亡。除了小鼠胚胎和大脑外，我们发现在小鼠肠内骨髓（BM），胸腺，脾脏和固有层淋巴细胞 （LPL）中， lncKdm2b均高水平表达。 然后， 我们采用RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）检测淋巴祖细胞和淋巴细胞中lncKdm2b的表达水平， 发现ILC3（Lin-CD45+ROR t+）中lncKdm2b高表达。同时采用CD127和CD45抗体染色和探针技术进一步验证了lncKdm2b的特异性。这些数据表明lncKdm2b涉及调控ILC3维护。
2、lncKdm2b缺失抑制ILC3增殖
ILC3数量减少可能是由细胞死亡增加或细胞扩增减少引起的。为了评估体内ILC3s的周转率，我们给予小鼠BrdU处理3d，然后采用流式细胞术测定小肠组织的摄取量。结果发现：与对照小鼠相比，lncKdm2b-/- 小鼠ILC3s的数量少得多。接下来，分离出野生型和lncKdm2b 缺失型ILC3s，用CFSE标记，并进行体内增殖测定。结果发现： 与野生型ILC3相比， lncKdm2b缺失型ILC3s的增殖显著降低。同样地，lncKdm2b缺失型ILC3中Ki67+细胞的数量远低于野生型ILC3。lncKdm2b过表达后恢复了ILC3s的增殖水平。 但是，lncKdm2b缺陷性小鼠中活性半胱天冬酶-3+ ILC3的百分比与野生型小鼠相当，这表明lncKdm2缺失性ILC3s未发生细胞凋亡。总之， lncKdm2b调节ILC3s的增殖，但不能调节细胞凋亡。
接下来，进一步确定lncKdm2b缺失引起的ILC3增殖变化是内在原因还是外在原因。我们将5 106 CD45.2+ lncKdm2b-/- 或lncKdm2b+/+小鼠BM细胞移植进入致死辐射的CD45.1+受体中。移植8周后，与lncKdm2b+/+ BM细胞受体相比，lncKdm2b-/-BM细胞受体的ILC3s数量减少。接着进行了竞争性BM移植实验，分别将CD45.1+野生型 和 CD45.2+ lncKdm2b+/+ 或lncKdm2b-/- BM细胞（1：1混合）移植到致死性辐射受体小鼠8周，结果发现：与lncKdm2b+/+ BM细胞的受体小鼠相比，lncKdm2b -/- BM细胞的受体小鼠的ILC3s数量减少。此外， 与来自lncKdm2b+/+BM细胞相比，来自lncKdm2b-/- BM细胞的ILC3s增殖减少。因此，用lncKdm2b-/-BM细胞重建的受体小鼠也容易遭受C.啮齿动物感染。总而言之，这些数据显示lncKdm2b是一个ILC3维护的内在因素。
3、LncKdm2b与Satb1相关联
反向性的lncRNA通常正向调节临近编码基因。由于lncKdm2b与 Kdm2b序列上反向转录，因此我们检测了lncKdm2b-/- ILC3s中Kdm2b和其它临近基因的表达水平，结果发现它们的表达水平都没受到影响。这些数据表明lncKdm2b可能以反式发挥调控作用，而不是顺式。
研究通过RNA pull down和蛋白质谱鉴定出组织蛋白Satb1可以与 LncKdm2b相结合，并通过RNA pull down和RAP进一步验证。 Satb1呈现高表达水平，而相关蛋白Satb2没检测到。研究通过结构域比对，发现一个特定片段（nt 450-700），是lncKdm2b和Satb1蛋白的特异性结合位点。 接着，通过RNA-EMSA进一步验证了该lncKdm2b片段与Satb1蛋白的结合位点。这些结果表明ILC3s中lncKdm2b直接与Satb1蛋白结合。
4、 LncKdm2b激活Zfp292的表达
为了进一步确定lncKdm2b调节的靶基因，我们进行lncKdm2b +/+ ILC3s和lncKdm2b -/- ILC3s的转录组芯片检测。在差异表达基因中，那些编码转录因子的基因在lncKdm2b -/- ILC3s中下调水平最为显著。 在下调最显著的前十名转录因子中，我们定位在一个没有特征的转录因子 Zfp292，它的表达水平下调了五倍，并通过实时荧光定量PCR和免疫印迹进一步验证了Zfp292在ILC3中的表达水平。值得注意的是，Zfp292优先在ILC3s中表达。为了进一步研究lncKdm2b是如何调节Zfp292的表达，我们通过CHIRP实验，发现lncKdm2b在Zfp292启动子的特定区域（nt -1,200至-600）富集。同时采用ChIP和DNase I accessibility 实验发现：在lncKdm2b-/- ILC3s中，这个zfp292启动子区域（nt -1,200到-600）的富集较少用于H3K4me3（组蛋白活性标记），但更多用于H3K27me3（组蛋白抑制性标记）。因此，lncKdm2b缺失导致Zfp292启动子上RNA聚合酶II的富集减少，这进一步强化了抗DNase I消化力。这些数据表明lncKdm2b在ILC3s中激活Zfp292表达。
鉴于lncKdm2b可以结合Satb1蛋白和Zfp292启动子区域，接下来试图研究Satb1蛋白是否参与了ZFp292的表达调控。ChIP实验结果表明Satb1是能够结合nt -1,200至-600的Zfp292启动子，EMSA也证实了这一发现。这些数据表明在ILC3s中Satb1可能参与lncKdm2b介导的Zfp292表达调控。研究采用CRISPR-Cas9技术在小鼠中敲除了Satb1，结果发现 Satb1敲除后显着抑制ILC3s中的Zfp292表达。 lncKdm2b -/- ILC3s中SATB1过表达能够挽救Zfp292的表达。因此，Satb1与lncKdm2b协同调节ILC3s中Zfp292的表达。
5、LncKdm2b募集Satb1和NURF到Zfp292启动子
据报道， Satb1通过募集活性或抑制性染色质重塑复合物到基因启动子来调控基因表达。因此，我们假设Satb1可以募集某些分子调节Zfp292的表达。研究制备了野生型和lncKdm2b缺失型LPL裂解物，并采用抗Satb1用于色谱分析。通过SDS-PAGE，然后进行银染和质谱分析。结果发现：lncKdm2b+/+ 和lncKdm2b-/- 两者相比，最为差异的谱带为Bptf和Snf2l，它们是NURF染色质重塑复合物的一部分。在lncKdm2b+/+ LPL裂解液中Satb1抗体与NURF复合物免疫共沉淀， 但在lncKdm2b-/-裂解物中不存在。
lncKdm2b可以增强Satb1和Bptf之间的相互作用，而如果没有lncKdm2b，Satb1结合不能结合Bptf。此外，lncKdm2b能够从Myc-Bptf过表达细胞裂解物中沉淀出Bptf，并通过RIP实验证实了这一结果。结构域比对发现， lncKdm2b的 450-1,000（nt）区域结合Bptf，并通过EMSA进一步验证。这些数据表明: 在lncKdm2b+/+ ILC3s中lncKdm2b是Satb1与NURF复合物相互作用的必要条件。那Bptf是如何参与Zfp292的表达调控，研究用抗Bptf进行ChIP实验，发现在ILC3s中Bptf在Zfp292启动子区域富集。但是， lncKdm2b敲除或Satb1敲除都会消除这种现象。通过交联处理发现，Satb1与NURF复合物在lncKdm2b+/+裂解物中，但不在lncKdm2b-/-裂解物中。同时，Zfp292启动子区域也可以在这些洗脱液中检测到。EMSA实验结果表明lncKdm2b与Satb1，Bptf和Zfp292启动子可以形成复合物区域，而用RNase A和RNase H处理可以破坏这个复合体的形成。因此，Bptf敲除可以抑制Zfp292表达，与Satb1敲除后细胞裂解物中得到的现象一致。这些数据表明lncKdm2b招募Satb1和NURF复合物到Zfp292启动子激活其表达。
6、Zfp292缺失损害ILC3的维持及功能
为了进一步研究Zfp292在ILC3s调节中的生理作用，通过CRISPR-Cas9建立了Zfp292缺陷小鼠方法，结果发现：与野生型小鼠相比，Zfp292-/- ILC3s的数量显着降低。同样地，IL-22+ ILC3的数量也显着降低。此外，Zfp292-/- ILC3s的增殖能力减弱。然而，Zfp292过表达后恢复了ZFp292缺失引起的ILC3增殖受损，这表明需要Zfp292来调节ILC3。值得注意的是，敲除Satb1和Bptf后能够抑制ILC3的增殖。在Satb1-缺陷型和Bptf缺陷型小鼠中ILC3的数量的确下调。同时，比同窝出生对照小鼠相比，Bptf缺陷型小鼠更易遭受C.啮齿动物感染。由于Satb1缺陷小鼠在出生后大约4周就死亡，因此，难以评估他们对C.啮齿动物感染的易感性。 与野生型小鼠相比，在lncKdm2b -/- Satb1-/- Bptf-/- ILC3s中Zfp292过表达可以挽救ILC3的增殖能力。
我们将lncKdm2b -/- Satb1-/- Bptf-/- Zfp292过表达的ILC3移植进入致死辐射的CD45.1+受体小鼠，发现在移植后8周Zfp292过表达恢复了ILC3s的数量。此外， lncKdm2b在Zfp292 -/- LPL中的过表达并没有挽救ILC3增殖，而lncKdm2b过表达在Zfp292 +/+ LPLs中促进ILC3增殖。因此，Zfp292 -/-小鼠更易受影响C.啮齿动物感染。最后，与其同窝出生相比，lncKdm2b -/- Zfp292-/-小鼠的ILC3数量大量减少。与野生型对照小鼠相比，lncKdm2b -/- Zfp292-/-小鼠更受细菌感染。总而言之，Zfp292在调控lncKdm2b介导的ILC3维持中发挥重要作用。
研究结论
PS:文章中涉及的基因芯片检测和数据分析由本公司完成！
参考文献：Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3maintenance by initiation of Zfp292 expression. Nature Immunology.2017.
北京中康博生物科技有限公司（beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD）是北方乃至全国最大的Affymetrix检测中心之一，公司以数据分析为特色，整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代测序、个性化生物信息分析三项核心服务。立足生命科学，为临床与基础研究领域的科学工作者提供分子生物学高端技术服务。
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