class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesPhospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。 >RRecombinant×什么是重组抗体，为什么它很重要？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。因此，重组抗体越来越多地用于科学研究，特别是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物组合。它们是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统易受遗传漂变和不稳定性，增加批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从组织培养上清液中纯化转染宿主细胞系的 nts。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，在实验使用之前，都必须始终在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb#8516Reviews ()引用 (414)过滤器：WBIPIHCIFF对未经处理 (-) 或经小牛肠磷酸酶 (CIP) 和 λ 磷酸酶 (+) 处理的 MCF7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析，使用Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb（上）或 Rb (4H1) Mouse mAb #9309（下）。显示更少显示更多 蛋白质印迹分析WI-38 细胞提取物，血清饥饿 3 天 (-) 或血清饥饿 3 天后用 10% 血清处理 2 天 (+)，使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP ® Rabbit mAb.Show LessShow More 使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（泳道 2）对 Cos 细胞提取物中的磷酸 Rb (Ser807/811) 进行免疫沉淀Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb（泳道 3）。泳道 1 是 10% 的输入。蛋白质印迹分析是使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 执行。显示更少显示更多 石蜡包埋的人肺癌的免疫组织化学分析，对照（左）或 λ 磷酸酶处理（右），使用磷酸化 Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® 兔单克隆抗体。显示更少显示更多 使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的小鼠脾脏进行免疫组织化学分析。显示更少显示更多 在对照肽（左）或抗原-存在的情况下，使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人卵巢浆液性腺癌进行免疫组织化学分析特定肽（右）。显示更少显示更多\"免疫荧光图像 1：Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb\">对未经处理（上）或经 λ 磷酸酶处理（下）的 MCF7（左）和 BT-549（右）细胞进行共聚焦免疫荧光分析）使用磷Rb (Ser807/Ser811) (D20B12) XP® 兔单克隆抗体（绿色）。肌动蛋白丝用 DY-554 鬼笔环肽（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。显示更少显示更多 使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 对 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析和碘化丙啶（PI/RNase Staining Solution #4087，用于测量 DNA 含量。抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 488 偶联物）#4412 用作二抗。显示LessShow More 图片库详细了解我们如何获取图像 × Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 8516 Toggle Between Dark and Light ModesFilter:WBIPIHCIFF 对未经处理 (-) 或经小牛肠磷酸酶 (CIP) 和 λ 磷酸酶 (+) 处理的 MCF7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析，使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb（上图）或 Rb (4H1) Mouse mAb #9309（下图）。WI-38 细胞提取物的蛋白质印迹分析、血清饥饿 3 天 (-) 或血清饥饿 3 天后用 10% 血清处理 2 天 (+)，使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb。使用免疫沉淀 Cos 细胞提取物中的磷酸化 Rb (Ser807/811)Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（泳道 2）或 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb（泳道 3）。泳道 1 是 10% 的输入。使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。 使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人结肠癌进行免疫组织化学分析。 使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人肺癌进行免疫组织化学分析，对照（左）或 λ 磷酸酶处理（右）。 石蜡包埋小鼠的免疫组化分析使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 的脾脏。使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP 对石蜡包埋的人卵巢浆液性腺癌进行免疫组织化学分析® 存在对照肽（左）或抗原特异性肽（右）的兔单克隆抗体。MCF7（左）和 BT-549（右）细胞的共聚焦免疫荧光分析，untrea使用 Phospho-Rb (Ser807/Ser811) (D20B12) XP® Rabbit mAb（绿色）处理（上）或 λ 磷酸酶处理（下）。肌动蛋白丝用 DY-554 鬼笔环肽（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。 使用 Phospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 和 Propidium Iodide (PI/RNase Staining Solution #4087 to measure DNA content) 对 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析。抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 488 偶联物）#4412 用作二抗。要购买 #8516Cat。#SizeQty.Price8516T20µl$1638516S100µl$407

添加到 BASKET® RabbitmAb\" class=\"btn btn-link btn-block\">定制配方

抗体保证FAQ技术支持——数据表--Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your RegionAmerica-EnglishEurope-ChineseEurope-DutchEurope-EnglishEurope-FrenchEurope-GermanEurope-ItalianEurope-KoreanEurope-PortugueseEurope-SpanishEurope-SwedishSupporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsSupporting DataREACTIVITYH M R MkSENSITIVITYEndogenousMW (kDa)110Source/IsotypeRabbitIgG应用密钥：WB -Western BlotIP-免疫沉淀IHC-免疫组化ChIP-染色质免疫沉淀C&R-CUT&RUNC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-人M-小鼠R-大鼠Hm-仓鼠Mk-猴病毒-病毒Mi-MinkC -ChickenDm-D. melanogasterX -XenopusZ-斑马鱼 B-BovineDg-DogPg-PigSc-S. cerevisiaeCe-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species ExpectedRelated ProductsConjugates

Product Information

Product Usage InformationApplicationDilutionWestern Blotting1:1000免疫沉淀1:200免疫组织化学（石蜡）1:200 - 1:800免疫荧光（免疫细胞化学）1:800 - 1:3200流式细胞术（固定/通透）化)1:200 - 1:800存储

以 10 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和少于 0.02% 叠氮化钠的形式提供。储存于 –20°C。不要等分抗体。

有关该产品的无载体（不含 BSA 和叠氮化物）版本，请参阅产品 #41359。

方案选择您的方案Western BlottingImmunoprecipitationImmunohistochemistry（石蜡)免疫荧光（免疫细胞化学）流式细胞术（固定/透化）PRINT

View >Collapse >

Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗以 5% w/v 孵育BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 在 4°C 下轻轻摇动，过夜。

注意：请参阅一抗推荐抗体稀释度的 ody 产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过添加准备新鲜的 3X 还原上样缓冲液1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X Transfer Buffer：将 100 ml 10X Transfer Buffer 添加到200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：( #9999). 封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation.Treat cells by adding fresh media containing regulator for desi 蛋白质印迹红色时间。从文化中吸取媒体；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。保持在冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选）转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中在室温下孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。II。一抗孵育在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂），在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测 10 ml 中的生物素化蛋白质标记物在室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)加入一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 ml，添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

天然蛋白质的免疫沉淀

本方案是旨在利用蛋白 A 琼脂糖珠对天然蛋白进行免疫沉淀，以通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析。

A.溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：立即添加 1 mM PMSF (#8553) p

3X SDS 样品缓冲液：蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包 (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液.Protein A 琼脂糖珠：(#9863).10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：(#9802) 要制备 1 ml 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 µl dH2O，混合。ATP（10 mM )（用于激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM)，请将 10 µl ATP (10 mM) 添加到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板中添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（10 cm) 并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。在 4°C、14,000 x g 下微量离心 10 分钟并转移 s上清液到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预清除（可选）涡旋混合珠子。将 10–30 µl 50% 蛋白 A 琼脂糖珠浆添加到 200 µl 细胞裂解物中，浓度为 1 mg/ml。在 4°C 下旋转孵育 30–60 分钟。 4°C 微量离心 10 分钟。将上清液转移到新试管中。继续进行下面的免疫沉淀。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，小鼠单克隆 IgG1 一抗使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415，Mouse (E5Y6Q) ) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆抗体nal IgG2b 一抗和 Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）以 1 mg/ml 的浓度添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。添加蛋白 A 琼脂糖（10–30 µl 50% 珠浆）。在 4°C 下旋转孵育 1-3 小时。在 4°C 下微量离心 30 秒。用 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次清洗之间保持在冰上。通过蛋白质免疫印迹或激酶活性（D 部分）进行样品分析。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀。涡旋，然后以 14,000 x g 微量离心 30 秒。将样品加热至 95–100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。将样品 (15–30 µl) 上样到 4–20% 凝胶上进行 SDS-PAGE。通过蛋白质印迹分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验方案）。

注意：当使用兔体内产生的一抗检测具有分子量在 50 kDa 范围内，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262)​​ 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (或 HRP 偶联物 #5127）作为二抗，以最大限度地减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量在 25 kDa 范围内的蛋白质，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以最大限度地减少变性小鼠轻链产生的干扰。

当使用小鼠产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (# 58802) 作为二抗最大限度地减少变性小鼠重链产生的干扰。

通过激酶分析进行分析用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一个管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 上 (4–20%)。

2008 年 12 月发布

2021 年 10 月修订

方案 ID：409

免疫组织化学（石蜡）A.溶液和试剂

注意：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

二甲苯。乙醇，无水变性，组织学级（100% 和 95%）。去离子水 (dH2O)。苏木精（可选）。洗涤缓冲液：1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：To 准备 1L 1X TBST，将 100ml 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 添加到 900 ml dH2O 中，混合。SignalStain® 抗体稀释剂 (#8112)。1X 柠檬酸盐暴露溶液：要制备 250 mL 1X 柠檬酸盐暴露溶液，用 225 mL dH2O 稀释 25 mlof SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746)。3% 过氧化氢：要制备 100 ml，将 10 ml 30% H2O2 添加到 90 mldH2O。封闭液：TBST/5% Normal Goat血清或 1X Animal-Free Blocking Solution.TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 ml 1X TBST 添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL dH2O 添加 1 ml无动物封闭溶液 (5X) (#15019)。检测系统：SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔 #8114）。底物：SignalStain® DAB 底物试剂盒 (#8059)。苏木精：苏木精 (#14166)。封片介质：SignalStain® Mounting Medium (#14177).B.脱石蜡/再水化

注意：在此过程中任何时候都不要让载玻片变干。

脱石蜡/水化秒方法：将切片在二甲苯中孵育三次，每次 5 分钟。在两次 100% 乙醇中孵育切片，每次 10 分钟。在两次 95% 乙醇中孵育切片，每次 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5分钟每个。抗原去掩蔽

对于柠檬酸盐：在微波中加热载玻片，浸没在 1X 柠檬酸盐去掩蔽溶液中，直到开始沸腾；随后在亚沸腾温度 (95°-98°C) 下 10 分钟。在工作台上冷却载玻片 30 分钟。

D.染色 在 dH2O 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。在 3% 过氧化氢中孵育切片 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。用 100–400 µl 封闭每个切片1 小时的首​​选封闭溶液在室温下处理 1 小时。去除封闭溶液并向每个切片添加 100–400 µl 用 SignalStain® AntibodyDiluent (#8112) 稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。将 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）平衡至室温ature.去除抗体溶液并用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。根据需要用 1–3 滴 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。将 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB 显色剂浓缩液加入 1 ml SignalStain® DABDiluent 中，并在使用前充分混合。应用 100–将 400 µl SignalStain® DAB 加入每个切片并密切监测。 1–10 分钟通常可提供可接受的染色强度。将载玻片浸入 dH2O 中。如果需要，用苏木精 (#14166) 对切片进行复染。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。脱水切片：将切片在 95% 乙醇中孵育两次每次 10 秒。在 100% 乙醇中重复，将切片孵育两次，每次 10 秒。在二甲苯中重复孵育切片两次，每次 10 秒。用盖玻片和封固剂 (#14177) 封固切片。检测试剂/底物相容性R推荐的检测试剂SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔）#8114SignalStain® Boost IHC 检测试剂（AP，兔）#18653COMPATIBLE CHROMOGENSignalStain® DAB Substrate Kit #8059SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713SignalStain®鲜艳的紫色过氧化物酶底物试剂盒 # 96632SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644

注意：使用本方案中指定以外的检测试剂可能需要进一步优化一抗考虑到检测试剂的不同灵敏度。

2010 年 2 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：283免疫荧光（免疫细胞化学）A.溶液和试剂

使用我们 #12727 Imm 中高效且经济的预制试剂获得更高质量的免疫荧光图像unofluorescence 应用解决方案套件

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O，混匀。将 pH 值调节至 8.0。甲醛：16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），使用新鲜的并打开的小瓶在 4°C 避光条件下储存，在 1X PBS 中稀释以备使用。封闭缓冲液（1X PBS / 5 % 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，混合均匀。搅拌的同时，加入 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100）：要制备 10 ml，将 30 µl Triton™ X-100 添加到 10 ml 1X PBS 中。混合均匀，然后加入 0.1 g BSA (9998)，混合。

推荐的荧光染料偶联的抗兔二抗：

抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor ® 488 共轭）#4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 555 偶联物）#4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 594 偶联物）#8889Anti-兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 647 偶联物）#4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

吸出液体，然后用在 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛覆盖细胞至 2–3 mm 的深度。

注意：甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

让细胞固定 15 分钟在室温下吸出固定剂，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。继续进行免疫染色（C 部分）。免疫染色

注意：除非另有说明，否则所有后续孵育均应在室温下进行，以防止干燥和荧光染料褪色g.

在封闭缓冲液中封闭样本 60 分钟。封闭时，按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭液，应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。冲洗在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。在抗体稀释缓冲液中稀释的荧光染料偶联二抗中室温避光孵育样本 1-2 小时。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。用 Prolong 盖玻片® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。为获得最佳效果，让封固剂在室温下固化过夜。对于长期储存，请将载玻片平放于 4°C 避光保存。

2006 年 11 月发布

2013 年 11 月修订

方案 ID： 24

流式细胞术，兔抗体 A 的甲醇透化协议。解决方案和试剂

此协议所需的所有试剂都可以有效地购买到在我们的细胞内流式细胞仪试剂盒（甲醇）#13593 中加入乙醚，或单独使用下面列出的目录号。

注意：使用反渗透去离子 (RODI) 水或同等等级的水制备溶液。

1X 磷酸盐缓冲液盐水 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛，无甲醇 (#47746)100% 甲醇 (#13604)：使用前冷却抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (PE Con​​jugate) #79408

注意：当包含荧光时实验中使用的细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等），推荐方案请参考染料产品页面。请访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于流式细胞术的细胞染料的完整列表。

B.固定

注意：贴壁细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。

注意：最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。通常，150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。

注意：如果使用全血，裂解红细胞并在固定前离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，则可以在固定前添加靶向 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，抗体将保持与目标靶标的结合。但是，请注意某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏因此不应在透化之前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

离心沉淀细胞并去除上清液。每 100 万个细胞用大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。充分混合以分离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者，细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。通透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入预冷的细胞中来通透细胞，同时轻轻涡旋，使甲醇的最终浓度达到 90%。在冰上通透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色（D 部分）或储存细胞在 -20°C 的 90% 甲醇中。免疫染色

注意：使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。

等分所需的 nu数个细胞放入试管或孔中。 （通常，每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。）通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。必要时重复。在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，该抗体在抗体稀释缓冲液中按推荐稀释度制备或通过滴定确定。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞（按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备）。在室温下孵育 30 分钟。避光。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。

2009 年 7 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id : 404

Specificity / SensitivityPhospho-Rb (Ser807/811) (D20B12) XP® Rabbit mAb 仅在 Ser807、Ser811 或两个位点被磷酸化时才识别内源水平的 Rb 蛋白。该抗体不与 Ser608 磷酸化的 Rb 发生交叉反应。物种反应性：

Human, Mouse, Rat, Monkey

Source / Purification

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals

研究背景

视网膜母细胞瘤抑癌蛋白Rb通过细胞周期G1期限制点控制进展来调节细胞增殖（ 1). Rb 具有三个功能不同的结合域，并与关键调节蛋白相互作用，包括转录因子 E2F 家族、c-Abl 酪氨酸激酶和具有保守 LXCXE 基序的蛋白质 (2-4)。 CDK 的细胞周期依赖性磷酸化抑制 Rb 靶标结合并允许细胞周期进展 (5)。 Rb失活化和随后的细胞周期进程可能需要细胞周期蛋白 D-CDK4/6 的初始磷酸化，然后是细胞周期蛋白 E-CDK2 磷酸化 (6)。已在体外观察到不同 CDK/细胞周期蛋白复合物的特异性 (6-8)，细胞周期蛋白 D1 是体内 Ser780 磷酸化所必需的 (9)。

Sherr, C.J. (1996) Science 274, 1672-7.Nevins, J.R. (1992) Science 258, 424-9.Welch, P.J. 和 Wang, J.Y. (1993) Cell 75, 779-90.Hu, Q.J.等。 (1990) EMBO J 9, 1147-55.Knudsen, E.S.和 Wang, J.Y. (1997) Mol Cell Biol 17, 5771-83.Lundberg, A.S.和温伯格，R.A. (1998) Mol Cell Biol 18, 753-61.Connell-Crowley, L. 等人。 (1997) Mol Biol Cell 8, 287-301.Kitagawa, M. 等人。 (1996) EMBO J 15, 7060-9.Geng, Y. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 194-9.Pathways

探索与该产品相关的通路。

选择您的通路G1/S 检查点蛋白质乙酰化×上游/下游蛋白质

STRING - Known 和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。

关闭数据库链接

UniProt ID:P06400

Entrez-Gene Id :5925

®\">在 PhosphoSitePlus®

有限使用

除非经 CST 合法授权代表签署的书面明确同意，否则以下条款适用于 CST 提供的产品，其附属公司或其分销商。任何客户的条款和条件是对此处包含的条款和条件的补充或不同于此处包含的条款和条件，除非 CST 的合法授权代表单独以书面形式接受，否则将被拒绝并且无效。

产品标有\"仅供研究使用”或类似的标签声明，未经 FDA 或其他国内外监管机构出于任何目的批准、批准或许可se。客户不得将任何产品用于任何诊断或治疗目的，或以任何与其标签声明相冲突的方式使用。 CST 销售或许可的产品提供给作为最终用户的客户，并且仅供研究和开发使用。将产品用于诊断、预防或治疗目的的任何使用，或为转售（单独或作为组件）或其他商业目的而购买的任何产品，都需要获得 CST 的单独许可。客户不得 (a) 不得向任何第三方单独或与其他材料一起出售、许可、借出、捐赠或以其他方式转让或提供任何产品，或使用产品制造任何商业产品，(b) 不得复制、修改、逆向工程、反编译、反汇编或以其他方式试图发现产品的底层结构或技术，或将产品用于开发与 CST 产品或服务竞争的任何产品或服务的目的，(c) 不更改或从产品中删除任何商标、商号、徽标、专利或版权声明或标记，(d) 仅根据 CST 产品销售条款和任何适用文件使用产品，以及 (e) 遵守任何许可，关于客户使用的与产品相关的任何第三方产品或服务的服务条款或类似协议。

仅供研究使用。不得用于诊断程序。Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。Alexa Fluor 是 Life Technologies Corporation 的注册商标。所有其他商标均为其各自所有者的财产。访问我们的商标信息页面。

>>> 更多资讯详情请访问蚂蚁淘商城