class=\"container-fluid\">支持数据Related ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesDi-Methyl-Histone H3 (Lys9) AntibodyDi-Methyl-Histone H3 (Lys9) Antibody#9753Reviews ()Citations (81)Filter:WBIPChIP使用 Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) Antibody 对 HeLa、NIH/3T3、H-4-II-E 和 COS 细胞的全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。显示更少显示更多 染色质免疫沉淀是执行无线来自 HeLa 细胞的交联染色质和 Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) Antibody 或 Normal Rabbit IgG #2729，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 SimpleChIP® Human AFM Intron 1 Primers #5098、SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486、SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers #7014 和 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers # 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量5516。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。显示更少显示更多图片库详细了解我们如何获取图像 × Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) Antibody 9753 在黑暗和光明模式之间切换过滤器：WBIPChIP 全细胞裂解物的蛋白质印迹分析es 来自 HeLa、NIH/3T3、H-4-II-E 和 COS 细胞，使用 Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) Antibody。

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抗体保证FAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your RegionAmerica -英语欧洲 - 中文欧洲 - 荷兰语欧洲 - 英语欧洲 - 法语欧洲 - 德语欧洲 - 意大利语欧洲 - 韩国欧洲 - 葡萄牙语欧洲 - 西班牙语欧洲 - 瑞典分析证明书相关产品产品使用方案背景途径引文和评论支持数据反应性H M R Mk Dm灵敏度内源性MW（kDa）17SOURCER兔应用程序密钥：WB-Western BlotIP-免疫沉淀IHC-免疫组化ChIP-染色质免疫沉淀C&R- CUT&RUNC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-HumanM-MouseR-RatHm-HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D。 melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species Expected相关产品

产品信息

产品使用信息

为获得最佳 ChIP 结果，使用 20 μl 抗体和 10 μg 染色质（约4 x 106 个单元）每个 IP。该抗体已使用 SimpleChIP® 酶促染色质 IP 试剂盒进行了验证。

应用稀释蛋白质印迹1:1000免疫沉淀1:50染色质 IP1:25储存以 10 mM 钠 HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油提供。储存于 –20°C。不要等分抗体。方案选择您的方案Western BlottingImmunoprecipitationChromatin IPPRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA 中孵育， 1X TBS，0.1% Tween® 20 在 4°C 下轻轻摇动，过夜。

注意：请参考一抗推荐抗体稀释度的产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过添加准备新鲜的 3X 还原上样缓冲液1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：( #9999). 封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过添加含有所需调节剂的新鲜培养基来处理细胞时间。从文化中吸取媒体；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选）转移后，wa在室温下用 25 ml TBS 冲洗硝酸纤维素膜 5 分钟。在室温下将膜在 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。II。一抗孵育在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂），在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测 10 ml 中的生物素化蛋白质标记物在室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 毫升，添加 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

天然蛋白质的免疫沉淀

本方案是旨在对天然蛋白质进行免疫沉淀，以便通过蛋白质免疫印迹或利用蛋白质 A 磁分离进行激酶活性分析。

A.溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：立即添加 1 mM PMSF (#8553)y 在使用前。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样中来制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液buffer.Protein A 磁珠：(#73778)。磁性分离架：(#7017) 或 (#14654)。10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：(#9802) 要制备 1 ml 1X 激酶缓冲液，添加 100 µl 10X 激酶缓冲液至 900 µl dH2O，mix.ATP (10 mM)（用于激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM)，将 10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲区.B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板中添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（10 cm) 并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。Microcentrif在 4°C 下以 14,000 x g 离心 10 分钟，然后将上清液转移到新试管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预澄清（可选）

强烈推荐细胞裂解物预澄清步骤，以减少非特异性蛋白质与 Protein A 磁珠的结合。预澄清足够的裂解物用于测试样品和同种型对照。

短暂涡旋储存管以重悬磁珠。

重要：使用前预洗 #73778 磁珠：

转移 20微升珠浆到干净的管中。将试管置于磁力分离架上 10-15 秒。

溶液澄清后小心取出缓冲液。向磁珠沉淀中加入 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液，短暂涡旋以清洗磁珠。将管放回磁力分离架。解决方案澄清后取出缓冲液。再次重复洗涤步骤。

将 200 μl 细胞裂解物加入 20 μl 预洗磁珠中。

IMPORTANT：最佳裂解物浓度取决于目标蛋白的表达水平。建议起始浓度在 250 μg/ml-1.0 mg/ml 之间。

在室温下旋转孵育 20 分钟。使用磁力分离架将珠子与裂解物分离，将预澄清的裂解物转移到清洁试管，并丢弃磁珠沉淀。继续进行免疫沉淀部分。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，小鼠单克隆 IgG1 一抗使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415，Mouse (E5Y6Q) ) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单抗克隆 IgG2b 一抗和 Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。形成免疫复合物。预洗磁珠（参见细胞裂解物预清除部分，步骤 1 和 2）。将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到含有预洗磁珠沉淀的试管中。旋转孵育室温 20 分钟。使用磁力分离架沉淀珠子。用 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次洗涤之间保持在冰上。继续通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析（D 部分）。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹法进行分析Resuspend沉淀与 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液混合，短暂涡旋混合，然后短暂微量离心以沉淀样品。将样品加热至 95-100°C 5 分钟。使用磁力分离架沉淀珠子。将上清液转移到新管中。上清液即为样品。通过蛋白质印迹法分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验步骤）。

注意：为尽量减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 引起的掩蔽，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（轻链Specific) (D4W3E) mAb (#45262)​​ 或小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）。为尽量减少变性 IgG 轻链 (~25 kDa) 引起的掩蔽，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）。

用于分析激酶测定 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 凝胶上。

2008 年 12 月发布

2021 年 4 月修订

方案 ID：410

染色质 IP

特定适用于产品：SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）#9005。

所需试剂

包括的试剂：

甘氨酸溶液 (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP 缓冲液 (10X) #7008ChIP 洗脱缓冲液 (2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA #7011ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006DNA Binding Buffer #10007DNA Wash Buffer（使用前加入 4 倍体积的乙醇）#10008DNA Elution Buffer # 10009DNA 纯化柱和收集管 #10010Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012RNAse A (10 mg/ml) #7013Micrococcal Nuclease #10011Proteinase K (20 mg/ml) #10012SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb（ChIP Formulated）#4620Normal Rabbit IgG #2729DTT（二硫苏糖醇）#7016

不包括试剂：

磁性分离架 #7017 / 14654磷酸盐缓冲盐水 (PBS-1X) pH7.2（无菌）#9872无核酸酶水 #12931乙醇 (96-100%) 甲醛（37% 储备液）SimpleChIP®通用 qPCR Master Mix #88989！这！表示协议中关于基于免疫沉淀准备 (IP 准备) 数量的体积变化的重要步骤。一份 IP 制备定义为 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 或分解组织。！！这 !!表示在继续之前稀释缓冲区的重要步骤。安全停止如果需要停止，这是协议中的安全停止点。组织交联和样品制备

采集组织时，去除不需要的物质，如脂肪和坏死物质来自样本的 ial。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻并储存在 -80°C 下供以后处理。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织每次免疫沉淀可能需要超过 25 mg。有关不同类型组织的预期染色质产量的更多信息，请参阅附录 A。应处理一份额外的染色质样品以进行染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。如果需要，应处理另外五个染色质样品以优化染色质消化（附录 B）。

开始前：

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中 IP 制备的数量按比例增加.

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻。准备 3 毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 每 25 mg 待处理组织并置于冰上。每 25 mg 待处理组织准备 45 µl 37% 甲醛并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的组织样本。对每个要执行的 IP 使用 25 mg 的组织（一个实验至少需要 75 mg 的组织，以包括阳性和阴性对照）。将组织样本放入 60 mm 或 100 mm 的培养皿中，并使用干净的细碎手术刀或刀片。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。向锥形管中每 25 mg 组织添加 1 ml PBS + PIC。要将蛋白质交联到 DNA，添加 45 µl 37每 1 ml PBS + PIC 的甲醛百分比，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。通过添加 100 &mi 停止交联cro;l 每 1 ml PBS + PIC 的 10X 甘氨酸并在室温下混合 5 分钟。在台式离心机中在 4°C 下以 500 x g 离心组织 5 分钟。去除上清液并用 1 ml PBS + 洗涤一次每 25 mg 组织的 PIC。在台式离心机中在 4°C 下以 500 x g 重复离心 5 分钟。去除上清液并在每 25 mg 组织中用 1 ml PBS + PIC 重悬组织并储存在冰上。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分）将组织分解成单细胞悬浮液。 （安全停止）或者，样品可以在分解前在 -80°C 下储存长达 3 个月。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中medicone（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。从底部收集细胞悬液使用 1 ml 注射器和 18 号钝针进入 medicone 室。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中并置于冰上。重复步骤 2 至 4，直到所有组织都处理成均质悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到所有组织都被研磨成均匀的悬浮液。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。在台式离心机中以 2,000 x g 的速度在 4°C 下将细胞离心 5 分钟。从细胞中去除上清液，然后继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）.C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中，并在台式离心机中 4°C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并继续使用 Nuclei Pr分离和染色质消化（第三部分）。细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 4 X 106 个细胞（至少需要 12 X 106 个细胞以包括阳性和阴性对照）。对于 HeLa 细胞，一个 IP 相当于 15 cm 培养皿的一半，其中含有在 20 ml 生长培养基中达到 90% 汇合度的细胞。应处理一个额外的样本用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。由于每种细胞类型都不同，我们建议在实验中加入一皿额外的细胞，用于使用血细胞计数器或细胞计数器测定细胞数量。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应增加根据使用的 15 cm 组织培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）的数量按比例分配。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 是完全解冻。准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC 每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）进行处理并置于冰上。每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）准备 40 ml PBS待处理并置于冰上。每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）准备 540 µl 37% 甲醛以进行处理并在室温下保存。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。要将蛋白质与 DNA 交联，请将 540 µl 37% 甲醛添加到每个包含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中。对于悬浮细胞，向悬浮在 20 ml 培养基中的细胞中加入 540 µl 37% 甲醛（为实现悬浮细胞的最佳固定，固定时细胞密度应低于 0.5 x 106 个细胞/ml）。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色变化。每 15 cm d 添加 2 ml 10X 甘氨酸含有 20 ml 培养基的 ish，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致培养基颜色发生变化。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰洗涤沉淀两次冷 PBS。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。对于贴壁细胞，去除培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。加入 2 ml 冰-冷 PBS + PIC 到每个 15 厘米的培养皿中。将细胞刮入冷缓冲液中。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。在 4°C 的台式离心机中以 2,000 x g 离心细胞 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。 （安全停止）或者，样品可以在 -80°C 下储存长达 3 个月。III。核前分离和染色质消化开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应根据实验中 IP 制备的数量按比例增加。

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。

(!!)重要提示：一旦溶解，将 1M DTT 储存在 -20°C 下。

取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确​​保 SDS 完全溶解.准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每次 IP 制备并置于冰上。准备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X 缓冲液 B #7007 + 825 µl 水）+ 0.55 µl 1M DTT 每次 IP 准备并置于冰上。准备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水）+ 0.5 µl 200X PIC 每次 IP 准备并置于ice. 在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT 中重悬细胞+ 每个 IP 准备的 PIC。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在 4°C 的台式离心机中以 2,000 x g 离心 5 分钟沉淀细胞核。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在每次 IP 制备时在 100 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管总量不超过 1 ml。每次 IP 制备添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011，倒置管数次混合，并在 37°C 下孵育 20 分钟，并频繁混合以消化 DNA到大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。将 DNA 消化至最佳长度所需的微球菌核酸酶的量可能需要根据个体组织和细胞系的经验确定（参见附录 B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化 HeLa 细胞核，用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化小鼠肝组织每 25 mg 组织中的 al 核酸酶提供适当长度的 DNA 片段。通过每次 IP 制备添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 并将试管置于冰上 1-2 分钟来停止消化。在微量离心机中以 16,000 x g 离心沉淀细胞核在 4°C 下静置 1 分钟并去除上清液。在 100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀，每个 IP 制备物在冰上孵育 10 分钟。每 1.5 ml 微量离心管超声处理多达 500 µl 裂解物，并多次脉冲打破核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在设置 6 和 1/8 英寸探头的 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核被完全裂解。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不像完成。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。 （安全停止）这是交联染色质制剂，应在 -80°C 下储存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。该 50 µl 样品可在 -20°C 下储存过夜。染色质消化和浓缩分析（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。使用 DNA 纯化离心纯化样品中的 DNA列如第 VII 节所述。 （安全停止）DNA 可在 -20°C 下保存长达 6 个月。纯化后提取 DNA，取出 10 µl 样品，在 1% 琼脂糖凝胶上用 100 bp DNA 标记进行电泳，确定 DNA 片段大小。 DNA 应被消化至大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。要确定 DNA 浓度，请将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中进行 50 倍稀释并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。理想情况下，DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适至关重要。染色质的过度消化可能会减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致 PCR 定量中的信号减弱。染色质消化优化方案见附录 B.

V。染色质免疫沉淀

For o为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 节中所确定）。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，在添加抗体之前，将 100 µl 消化的染色质稀释到 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要超过 100 µl 的染色质，则交联染色质制备物无需按如下所述进行稀释。抗体可直接添加到未稀释的染色质制剂中，用于染色质复合物的免疫沉淀。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

去除和温暖的 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解解冻消化的染色质制剂（来自第 III 部分中的步骤 9）并置于冰上。准备低盐洗涤液：每次免疫沉淀 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：每次免疫沉淀 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水）+ 70 µl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。在一个试管中，准备足够的 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl每次免疫沉淀 200X PIC。确定免疫沉淀次数时，请记住包括阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。向准备好的 1X ChIP 缓冲液中加入相当于 100 µl（5 至 10 µg染色质）的消化，交联染色质制备（来自第 III 部分的步骤 9）每免疫沉淀。例如，对于 10 次免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl 稀释染色质样品并转移到微量离心管。这是您的 2% Input Sample，可在 -20°C 下保存直至进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体.每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 µl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。如果使用来自 Cell S 的抗体ignaling Technology，请参阅数据表或产品网页上列出的推荐稀释度，并根据 Cell Signaling 抗体浓度计算阴性对照的 IgG 抗体量 (µg)，以进行公平比较。将 IP 样品在 4°C 下旋转孵育 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 的大多数抗体在每个 IP 样品 1 到 2 微克之间发挥最佳作用。如果有多个浓度不同的样品，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟，使溶液变澄清，然后小心去除上清液。清洗蛋白 G 磁石通过向珠子中加入 1 ml 低盐洗涤液并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟来分离珠子。再重复步骤 6 和 7 两次，共进行 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液加入磁珠中，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。通过将磁选架中的试管。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

取出并加热 2X ChIP 洗脱在 37°C 水浴中缓冲 #7009，并确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）用于每个免疫沉淀物和 2% 输入样品。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中，并在室温下放置直至步骤 6。向每个 IP 样品添加 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液。从抗体/蛋白 G 磁珠在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）30 分钟。恒温器最适合此步骤。或者，洗脱可以在室温下旋转进行，但可能不那么完整。通过将管放在磁力分离架上沉淀蛋白 G 磁珠，等待 1 至 2 分钟使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到向所有试管（包括来自步骤 1 的 2% 输入样品）添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012 进行反向交联，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存最多 4 天。然而，为了避免d 沉淀物的形成，确保在添加 DNA Binding Buffer #10007（第 VII 部分，步骤 1）之前将样品加热至室温。使用离心柱纯化 DNA 开始前 (!!) 使用前将 24 ml 乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。从第 V 部分中取出每个 DNA 样本的 DNA 纯化收集管 #10010。向每个 DNA 样本中添加 750 µl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋。5每 1 体积样品应使用 30 倍体积的 DNA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样品 450 µl 转移至收集管中的 DNA 离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从离心管中取出离心柱收集管并丢弃液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。添加 750 µl DNA将缓冲液 #10008 洗涤至收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。将 50 µl DNA 洗脱缓冲液 #10009 添加到每个离心柱中，然后放入干净的 1.5 ml 微量离心管中。在微量离心机中以 18,000 x g 离心 30 秒以洗脱 DNA。移除并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可以储存在 -20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户正在执行来自另一个物种的 ChIP，建议用户设计合适的 DNA 特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。PCR 引物的选择至关重要。引物设计应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°CO 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（用于标准 PCR）80 至 160 bp（用于实时定量 PCR）标准 PCR 方法根据要分析的样品数量标记适当数量的 0.2 ml PCR 管。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。试剂1 次 PCR 反应的体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP Mix 1.0 µl5 µM RPL30 引物 2.0 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。延伸 72°C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最终延伸 72°C 5 分钟 从每个 PCR 产物中取出 10 微升，用带有 100 bp DNA 标记的 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照正常兔 IgG 样品、不含 DNA 的试管以控制污染，以及连续稀释的2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25、1:125）以创建标准曲线并确定扩增效率。将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个管或孔中.如下所述制备主反应混合物。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。 （安全停止）如有必要，用铝箔盖板避光，并在 4°C 下储存最多 4 小时或 -20°C 过夜，直到机器准备好使用。1 次 PCR 反应的试剂体积 (18 µl)无核酸酶 H2O 6 µl5 µM RPL30 引物 2 µlSimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，总共 40 个循环。

使用随附的软件分析定量 PCR 结果e 实时 PCR 仪。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)

C[T] = CT = PCR反应的阈值循环

IX. NG 测序文库构建

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 ChIP-seq 兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们推荐用于 Illumina® 的 DNA 文库制备试剂盒（ChIP-seq、CUT&RUN）#56795 和其相关的索引引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#29580 或 Multiplex Oligos for Illumina®（双索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#47538.

建议：

对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP 富集 DNA 并使用 10 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。对于总组蛋白和组蛋白修饰，或输入样本，从 50 ng ChIP 富集 DNA 开始，并使用 6 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。对于所有目标类型的 ChIP 富集 DNA 文库构建，执行接头清理-没有大小选择的连接 DNA。构建 DNA 文库后，使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（安捷伦科技，目录号 G2938-90322）或通过琼脂糖凝胶电泳检查 DNA 文库是否存在接头二聚体（~140 bp） 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，请重复清理 PCR 扩增材料。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应具有相同的高信号与阴性引物相比，如在对 ChIP 富集 DNA 的原始 qPCR 分析中所见。在最终清理和质量检查后，准备 2-10 nM 的最终纯化文库样本以进行高通量测序。附录 A：预期染色质产量

当从组织样本中收获交联染色质，染色质的产量在组织类型之间可能会有很大差异。右表提供了与 4 x 106 HeLa 细胞相比，25 毫克组织的染色质预期产量范围，以及预期的 DNA 浓度，如方案第 IV 节中所确定。对于每种组织类型，使用Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器产生相似数量的染色质。但是，使用 Medimachine 解聚的组织处理的染色质通常比使用 Dounce 匀浆器解聚的组织处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 匀浆器来分解脑组织ue，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬液。为获得最佳 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，有些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞总染色质产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg/25 mg 组织 200-300 µg/ml 肝脏 10-15 µg/25 mg 组织 100- 150 µg/ml 肾脏 每 25 mg 组织 8-10 µg 80-100 µg/mlBrain 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/ml 心脏 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/mlHeLa 10-15 µg每 4 x 106 个细胞 100-150 µg/ml 附录 B：染色质消化的优化

将交联染色质 DNA 消化至 150-900 个碱基对长度的最佳条件在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织数量或细胞数量。以下是协议 f或确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件。

如第 I、II、和 III. 在第 III 部分的第 2 步后停止并按如下所述进行。将 100 µl 细胞核制备物转移到 5 个单独的 1.5 ml 微量离心管中并置于冰上。将 3 µl 微球菌核酸酶原液添加到 27 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中（酶的 1:10 稀释度）。向步骤 2 中的 5 个试管中的每一个添加 0 µl、2.5 µl、5 µl、7.5 µl 或 10 µl 稀释的微球菌核酸酶，颠倒试管数次混匀并孵育在 37°C 下频繁混合 20 分钟。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 并将试管置于冰上来停止每次消化。在微量离心机中在 4°C 下以 16,000 x g 离心 1 分钟沉淀细胞核并去除上清液。重悬核沉淀在 200 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中。公司ubate 在冰上 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核完全裂解，设置为设置 6，带有 1/8 英寸探头。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不那么完整。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将 50 µl 的每种超声裂解物转移到新的微量离心管中。向每 50 µl 样品中加入 100 µl无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2 µl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合，然后我在 65°C 下孵育样品 2 小时。从每个样品中取出 20 µl，并通过在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。观察哪种消化条件产生的 DNA 在 150 的所需范围内-900 个碱基对（1 至 5 个核小体）。使用此优化方案产生所需大小的 DNA 片段的稀释微球菌核酸酶体积相当于应添加到一种免疫沉淀制备物（25 毫克分解组织细胞或 4 X 106 组织培养物）中的微球菌核酸酶原液体积的 10 倍细胞）以产生所需大小的 DNA 片段。例如，如果 5 µl 稀释的微球菌核酸酶在此实验方案中产生 150-900 个碱基对的 DNA 片段，则在第 III 部分的染色质消化过程中，应将 0.5 µl 微球菌核酸酶原液添加到一次免疫沉淀制备中。如果结果表明DNA 不在所需的大小范围内，然后重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以改变消化时间以增加或减少 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1。消化染色质的浓度太低。添加到染色质消化中的细胞不足或细胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制剂的 DNA 浓度接近 50 µg/ml，则向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。

对单独的细胞板进行计数在交联之前确定准确的细胞数和/或在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核完全裂解。

2.染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。

细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

过多的 c染色质消化中添加的微球菌核酸酶不足或不足。

在固定的甲醛浓度下执行时间过程。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以优化染色质消化。

3 .染色质过度消化且片段太小（仅 150 bp 单核小体长度）。将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会在 PCR 定量期间减弱信号，尤其是对于长度大于 150 bp 的扩增子。没有足够的细胞或添加到染色质消化中的微球菌核酸酶过多。在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，有关染色质消化的优化，请参见附录 B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。

添加到 IP 中的染色质不足或染色质过度消化。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环。

使用从交联和消化的染色质中纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到 150 bp 以下（参见第 VIII 节中的引物设计建议）。

为获得最佳的 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。

5．阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中没有产物。

IP 反应中加入的染色质或抗体不足或 IP 孵育时间太短。

Protein G beads 染色质洗脱不完全。

务必添加 5- 10 µg 染色质和 10 µl 抗体用于每个 IP 反应，并与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 后再孵育 2 小时

在 65°C 下从 Protein G 珠子上洗脱染色质是最佳的，并经常混合以保持珠子悬浮在溶液中。

6.阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。

IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者，IP 反应中添加了过多的抗体。

PCR 反应中添加了过多的 DNA 或扩增循环过多。

添加的染色质不超过 15 µg 和 10微升组蛋白 H3 抗体用于每个 IP 反应。将每次 IP 的正常兔 IgG 的量减少至 1 µl。

在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环数。在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物非常重要。否则无法准确测定起始DNA量的差异。

7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。

IP 反应中加入的抗体不足。

抗体对 IP 不起作用。

向 PCR 反应中加入更多 DNA 或增加扩增循环数。

IP 反应通常添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；但是，确切的量在很大程度上取决于单个抗体。

增加添加到 IP 的抗体量。寻找替代抗体来源。

2011 年 12 月发布

2022 年 4 月修订

方案 ID：82

特异性 /灵敏度Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) Antibody 仅在 Lys9 上二甲基化时检测组蛋白 H3 的内源水平。该抗体不会与非甲基化、单甲基化或三甲基化的 Lys9 发生交叉反应。此外，该抗体不会与二甲基化或三甲基化组蛋白 H3 Lys27 发生交叉反应。物种反应性：

Human, Mouse, Rat, Monkey, D. melanogaster

来源/纯化

多克隆抗体s 是通过使用与组蛋白 H3 的氨基末端相对应的合成肽对动物进行免疫而产生的，其中赖氨酸 9 是二甲基化的。抗体通过蛋白 A 和肽亲和层析纯化。

背景

核小体由四种核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4）组成，是染色质的主要组成部分。组蛋白最初被认为是 DNA 包装的静态支架，现在已被证明是动态蛋白质，可以进行多种类型的翻译后修饰，包括乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化 (1)。组蛋白甲基化是基因组活性和非活性区域形成的主要决定因素，对于发育过程中基因组的正确编程至关重要 (2,3)。组蛋白 H3 (Arg2, 17, 26) 和 H4 (Arg3) 的精氨酸甲基化促进转录激活，并由蛋白质精氨酸甲基转移酶 (PRMT) 家族介导，包括共激活因子 PRMT1 和 CARM1 (PRMT4) (4)。相比之下，已经确定了一组更多样化的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，除了其中一个之外，所有这些酶都包含一个最初在果蝇 Su(var)3-9、增强子 zeste 和 Trithorax 蛋白中发现的保守催化 SET 结构域。赖氨酸甲基化主要发生在组蛋白 H3（Lys4、9、27、36、79）和 H4 (Lys20) 上，并且与转录激活和沉默有关 (4)。这些赖氨5-8). PADI4、LSD1、JMJD1、JMJD2 和 JHDM1 等组蛋白去甲基化酶的发现表明甲基化是一种可逆的表观遗传标记 (9)。

Peterson, C.L.和 Laniel, M.A. (2004) Curr Biol 14, R546-51.Kubicek, S. 等。 (2006) Ernst Schering Res Found Workshop, 1-27.Lin,W. 和 Dent, S.Y. (2006) Curr Opin Genet Dev 16, 137-42.Lee, D.Y.等。 (2005) Endocr Rev 26, 147-70.Daniel, J.A.等。 (2005) Cell Cycle 4, 919-26.Shi, X. et al. (2006) Nature 442, 96-9.Wysocka, J. 等人。 (2006) Nature 442, 86-90.Wysocka, J. 等人。 (2005) Cell 121, 859-72.Trojer, P. 和 Reinberg, D. (2006) Cell 125, 213-7.Pathways

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