简
介
蛋白修饰研究系列文章
蛋白质是各种细胞功能最重要的执行者，其功能正常与否决定着生命活动能否有序、高效的进行，而其中翻译后修饰（Post-translational modification，缩写为PTM）起着至关重要的作用。翻译后修饰改变了蛋白质中不同氨基酸残基上的生物化学官能团，进而改变其化学性质或结构，使得蛋白质具有更为复杂的结构和更为完善的功能，实现更为精细的调节。
蛋白质的翻译后修饰过程极其复杂，已知的翻译后修饰种类有20多种。但其中较为常见的主要是磷酸化、泛素化、SUMO化、酰（含乙酰）化、甲基化以及糖基化。本系列推文将对蛋白修饰位点的鉴定或筛查、搜索及预测、检测、功能分析等问题分别展开讨论，大家可以持续关注。
系列文章（一）
蛋白修饰位点的鉴定或筛查
蛋白修饰位点的鉴定方法
大家在进行蛋白翻译修饰研究的时候，第一步往往分为两种情况：对已知或已经报道的位点进行筛查，或对未知的新位点进行从头鉴定，以确定和自己研究有关的候选位点。
根据蛋白修饰研究目的和需求不同，蛋白修饰位点的鉴定方法大致可分为质谱鉴定法和抗体芯片筛选分析法两种。因为CST主要专注于以质谱分析为基础的高通量鉴定方法，所以本文集中介绍蛋白修饰的质谱鉴定原理和方法。
质谱鉴定法原理及流程
在过去20年来，质谱分析已成为确定蛋白质修饰类型和位点的必不可少的工具。质谱分析可用于纯化的蛋白质或蛋白质混合物（如细胞裂解液）。用蛋白内切酶（如胰蛋白酶）把某单一蛋白或蛋白混合物消化成小分子多肽片段，然后经富集和纯化后，利用质谱分析这些多肽片段，以确定其m/z值（质荷比）。由于酶切位点是已知的，所以就可以用计算机程序，根据质量确定每个肽段的特定氨基酸序列。由于磷酸基等分子的分子量和电荷是已知的，所以也可以检测肽段中特定氨基酸的磷酸化。因此，质谱可用于多肽氨基酸序列的确定、多肽和蛋白质的分子量测定、多肽和蛋白质的相对定量和翻译后修饰的检测。
对于修饰肽段和翻译后修饰的分析，先用反相色谱分离多肽，然后馏分收集和用质谱分析(LC/MS)。为了更准确地确定肽段修饰的性质，经常用串联质谱(MS/MS)实验。
第一个MS步骤后，用惰性气体撞击多肽离子，从而导致进一步的碎片化。然后在第二个MS步骤分析这些多肽片段。在此过程中，有些修饰肽段将保持不变，产生的肽段模式类似于未相撞的肽段，有些肽段将显著碎片化，产生的肽段模式可以为修饰氨基酸的性质和位点提供进一步的信息。
质谱的更多用途
质谱既可被用来确定单一蛋白质的修饰状态，还被用来确定带有某种特定修饰（如磷酸化）的所有蛋白质的广泛数据集。这种技术被用于确定带有这种修饰的“亚蛋白质组”，例如磷酸化蛋白质组分析癌症中整个信号网络的激活状态。
质谱鉴定的局限
然而，目前质谱分析还存在一些局限，不能完全检测所有多肽片段，有些肽段清晰可见，有些肽段不可见，这对于复杂混合物的分析通常是一个主要问题。另外，由于蛋白质修饰的丰度低以及离子化效率低，带有某种修饰的肽段质谱信号会被无修饰的肽段质谱信号压制，因此在蛋白修饰的质谱分析鉴定前，依然需要结合富集技术以便于提高信噪比，这通常涉及到质谱分析前的亲和层析。
富集方法
不同类型修饰有不同的富集方法，如表1所示。
PTM 类型
富集方法
磷酸化
金属离子亲和层析（IMAC, TiO2）
Motif 抗体富集
酰化（如乙酰化等）
Motif 抗体富集
甲基化
Motif 抗体富集
泛素化和类泛素化
Motif 抗体富集
含有标签序列的泛素或类泛素化表达载体转入细胞，利用标签抗体富集泛素或类泛素化蛋白
“什么是基序抗体呢？和修饰位点特异性抗体有什么不同呢？”
基序，英文是motif，亦称模序、模体，是指DNA、蛋白质等生物大分子中的保守序列或符合一定排列规律的核苷酸或氨基酸组合。对于蛋白修饰位点来说，基序（motif）往往指某种修饰所连接的氨基酸残基周围序列的排列规律。比如，Phospho-PKASubstrate (RRXS*/T*) (100G7E) Rabbit mAb#9624，PKA（蛋白激酶A）在其底物的(R)(R)X(S/T)序列进行特异性磷酸化，这个序列的特征是在磷酸化修饰的丝氨酸/苏氨酸（S/T）的-2和-3位常常为精氨酸（R），而X代表丝氨酸/苏氨酸（S/T）的-1位可以是任意氨基酸。那么，能够识别这些不同基序（即各种修饰所在位点及周围氨基酸各种排列组合）的抗体就叫做motif 抗体。
和标准的位点特异性修饰抗体（如Phospho-Akt(Ser473) (D9E) XP®Rabbit mAb#4060）不同，motif抗体是识别修饰所在位点及周围氨基酸各种排列组合的抗体，能够识别的潜在蛋白修饰肽段非常多。而标准的位点特异性修饰抗体是精确识别某一个蛋白的某一个特定修饰位点（修饰位点周围的氨基酸序列也是确定的）的抗体。
CST是最早开始研发基序（motif）抗体的公司，并在过去十多年开发出一系列能够识别这些不同修饰位点基序的motif抗体，大大推进了利用质谱对蛋白各种修饰位点信息的高通量分析。当然，CST的位点特异性修饰抗体的种类非常多，达20多种，针对1000多个靶点，引用文献无数。因此，CST获得了CiteAb 2017 “PTM antibody of the Year”（蛋白翻译后修饰抗体的引用文献占有率在65%以上）。
具体而言，CST提供很多用于在质谱分析前对不同类型修饰肽段进行富集及常规分析的试剂（见表2~表6）。
表2：磷酸化修饰肽段富集相关抗体试剂
磷酸化修饰肽段IP富集试剂盒（用于蛋白组学分析）
产品货号
产品名称
规格
75676
PTMScan®Multi-Pathway Enrichment Kit
10次IP
8803
PTMScan(R) Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) Kit
10次IP
5636
PTMScan(R) Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) Kit
10次IP
14478
PTMScan(R)Pilot Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) Kit
3次IP
91336
PTMScan(R) Phospho-Thr-X-Arg Motif [pT(P/X)R] Kit
10次IP
5567
PTMScan(R) Phospho-T*PP Motif (T*PP) XP(R) Rabbit mAb Kit
10次IP
5566
PTMScan(R) Phospho-ST*P Motif (ST*P) XP(R) Rabbit mAb Kit
10次IP
14989
PTMScan(R) Phospho-Ser-Pro-Pro Motif [pSPP] Kit
10次IP
28303
PTMScan(R) Phospho-Ser/Thr-Pro Motif [p(S/T)P] Kit
10次IP
25081
PTMScan(R) Phospho-Ser/Thr Motif [pS/T] Kit
10次IP
71652
PTMScan(R) Phospho-PKC Substrate Motif [(R/K)(R/K)Xp(S/T)X(R/X)] Kit
10次IP
5565
PTMScan(R) Phospho-PKA Substrate Motif (RRXS*/T*) Kit
10次IP
10821
PTMScan(R) Phospho-PDK1 Docking Motif [(F/Y)p(S/T)(F/Y)] Kit
10次IP
4652
PTMScan(R) Phospho-MAPK/CDK Substrate Motif (PXS*P and S*PXK/R) Kit
10次IP
14990
PTMScan(R) Phospho-MAPK Substrate Motif [PXpTP] Kit
10次IP
12170
PTMScan(R) Phospho-CK2 Substrate Motif (S*/T*DXE) Kit
10次IP
12267
PTMScan(R) Phospho-ATM/ATR Substrate Motif [pSQ] Kit
10次IP
5564
PTMScan(R) Phospho-AMPK Substrate Motif (LXRXXS*/T*) Kit
10次IP
5563
PTMScan(R) Phospho-Akt Substrate Motif mAb 2 (RXRXXS*/T*) Kit
10次IP
5561
PTMScan(R) Phospho-Akt Substrate Motif mAb 1 (RXXS*/T*) Kit
10次IP
32948
PTMScan(R) Basophilic Kinase Substrate Motif [(R/X)(R/X)Xp(S/T)] Kit
10次IP
表3：酰化修饰肽段富集相关抗体试剂
酰化修饰肽段IP富集试剂盒（用于蛋白组学分析）
产品货号
产品名称
规格
14499
PTMScan(R)PilotAcetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit
3次IP
13416
PTMScan(R) Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit
10次IP
13764
PTMScan(R) Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit
10次IP
17848
PTMScan(R) Propionyl-Lysine [Prop-K] Kit
10次IP
93872
PTMScan(R) Malonyl-Lysine [Mal-K] Kit
10次IP
26101
PTMScan(R) Glutaryl-Lysine [Glut-K] Kit
10次IP
表4：泛素化及类泛素化修饰肽段富集相关抗体试剂
泛素化及类泛素化修饰肽段IP富集试剂盒（用于蛋白组学分析）
产品货号
产品名称
规格
14482
PTMScan(R)PilotUbiquitin Remnant Motif (K-epsilon-GG) Kit
3次IP
5562
PTMScan(R) Ubiquitin Remnant Motif (K-epsilon-GG) Kit
10次IP
表5：甲基化修饰肽段富集及常规分析相关抗体试剂
甲基化修饰肽段IP富集试剂盒（用于蛋白组学分析）
产品货号
产品名称
规格
14809
PTMScan(R) Pan-Methyl Lysine Kit
10次IP
12235
PTMScan(R) Mono-Methyl Arginine Motif [mme-RG] Kit
10次IP
13563
PTMScan(R) Symmetric Di-Methyl Arginine Motif [sdme-RG] Kit
10次IP
13474
PTMScan(R) Asymmetric Di-Methyl Arginine Motif [adme-R] Kit
10次IP
86506
PTMScan(R) Lysine/Arginine Modification Antibody Sampler Kit
10次IP
表6：Caspase切割肽段富集相关抗体试剂
Caspase切割肽段IP富集试剂盒（用于蛋白组学分析）
产品货号
产品名称
规格
12810
PTMScan(R) Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] Kit
10次IP
质谱：可对已知修饰点进行高通量评估
利用质谱除了对于未知的蛋白修饰进行高通量评估以外，还能不能对已知的修饰位点进行高通量评估呢？
答案是可以的。
其实，CST经过长期的探索和积累，也已经制备了针对已知修饰位点肽段进行富集的试剂#75676（点击此处了解#75676的具体介绍）用于质谱分析前的修饰肽段富集和纯化。
并且，CST也可以提供包括未知或已知修饰位点肽段富集和质谱分析的全套服务。有关详细信息，可下载《简易蛋白组学》手册以及《翻译后修饰蛋白质组学研究的新技术策略》进行阅读。
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