腺病毒载体疫苗的制备与分离-蚂蚁淘在线

在病毒载体家族里面，腺病毒的应用非常广泛，它具有诱导抗体和T细胞组合反应的潜能。虽然人群中广泛存在的先天免疫可能会使人源腺病毒疫苗载体的效果大打折扣，但是如果采用灵长类动物来源的腺病毒或者人源稀有型腺病毒就可以克服这一障碍，保证安全的同时免疫原性也大大提升，采用腺病毒平台的埃博拉疫苗已经在中国上市，而且很多项目处于临床阶段和临床前，针对的疾病包括疟疾、中东呼吸综合症(MERS)、呼吸道合胞病毒和多种癌症。

腺病毒(Adenovirus)

是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。

图片来源:https://www.innovationtoronto.com

虽然非复制性腺病毒载体(Ad)的GMP级别生产方法并不少见，但是依然存在很多挑战。面临突发疫情，如何快速为临床前实验生产匹配GMP要求的腺病毒疫苗变的尤为重要，该工艺需要具有可放大性、简洁性，尽可能采用一次性技术，能够很快的进行生产场地转移与调整。

最近，默克技术团队联合牛津大学Jenner研究所对基于灵长类来源的三种腺病毒载体疫苗(ChAdOx2，针对狂犬病；ChAd63，针对疟疾；ChAdOx1，针对裂谷热)的工艺开发进行了系统研究，结果表明：该方案具有非常好的平台性，少许改动便可以在不同的腺病毒血清型疫苗中进行切换，面对突发疫情可以在短时间内完成临床前样品工艺开发工作¹。

特地摘录，以飨读者

一、上游技术

1、细胞株与发酵罐

悬浮培养HEK293 T-rex细胞，并逐渐降低FBS浓度至0.5%，接种于Mobius®发酵罐中，接种密度为1.5-2.0*106 cells/mL，DO设定为50%空气饱和度，pH设置为7.2-7.3 (CO2或7.5%碳酸氢钠)，采用MOI (感染复数)为3进行病毒接种，3小时后，加入1.5倍体积新鲜培养基。

2、细胞裂解、核酸酶消化以及澄清

病毒感染42h后，加入1/9发酵液体积的裂解缓冲液(10% v/v聚山梨醇酯 20，50%w/v蔗糖，20mM MgCl2，500mM Tris pH8.0，Benzonase® 60 units/mL)，关闭DO与pH控制，保持搅拌，37℃。2h后，采用Millistak+® HC Pro C0SP深层滤器进行澄清处理，通量为6.6 L/min/m2。使用之前采用1% v/v聚山梨醇酯20，5%w/v 蔗糖，2 mM MgCl2，50mM Tris pH8.0缓冲液进行滤器润洗及排气。

二、下游技术

1、浓缩与透析

澄清完成后采用Pellicon® 2 BioMax 300KD (C筛网)TFF进行切向流浓缩换液，为下游纯化做准备，通量为6 L/min/m2。完成6-10浓缩后换到层析平衡液: 100 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.1% v/v聚山梨醇酯20、5% w/v蔗糖、50mM bis-tris、pH6.5。

2、层析

筛选了三种膜层析介质，包括Natrix® Q膜层析，采用过量上样纯化后的腺病毒载体的方式测定动态结合载量，用A280进行判定。步骤为：上样后清洗10个膜体积，然后1M NaCl、1mM MgCl2、 0.1% v/v 聚山梨醇酯20、 5% w/v 蔗糖、 50mM Tris-HCl、 pH 8.0。

3、浓缩换液与除菌过滤

层析结束后，采用和3一样的TFF滤器进行第二次浓缩换液，通量为0.83 L/min/m2，交换至A438缓冲液中(10mM 组氨酸、7.5%蔗糖、35mM NaCl、1mM MgCl2、0.1% PS-80、0.1mM EDTA、0.5%v/v乙醇 pH6.6、跨膜压为0.5bar)。最后采用0.2um滤器Millipak®-20进行除菌过滤。

4、下游收率

小结

简而言之，该方案上游采用了Mobius®一次性生物反应器技术，具有放大性好，无需验证的特点。下游采用默克全新的Millistak® C0SP深层过滤膜包进行料液澄清，Pellicon® 2 BioMax 300 KD TFF (C筛网)膜包进行浓缩换液。下游层析步骤筛选了Natrix® Q膜层析介质，具有高流速，高载量的特点，尤其是um级的开孔，比传统柱层析更有利用病毒类颗粒的结合，同时也无需验证，既用既抛。最后同样采用Pellicon® 2 BioMax 300 KD TFF (C筛网)进行浓缩以及制剂缓冲液置换，最后采用0.2um滤器Millipak®-20进行除菌过滤。

整套方案流程简洁、可操作性强、平台性好，可以借鉴在多种腺病毒载体疫苗或腺病毒转基因载体工艺开发，快速应对突发疫情。

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注释及参考文献：

1．Sofiya Fedosyuk , Thomas Merritt, et, Vaccine, 2019Nov 8;37(47):6951-6961