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商品描述
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제품특징
□ 농도 2~5 U/㎕
□ 형상
| 200 mM | Potassium Phosphate (pH6.5) |
| 10 mM | 2-Mercaptoethanol |
| 50% | Glycerol |
□ 보존 -20℃
□ 첨부 Buffer 조성(10×)
| 330 mM | Tris-acetate (pH7.9) |
| 660 mM | CH3COOK |
| 100 mM | (CH3COO)2Mg |
| 5 mM | DTT |
□ 기원
Escherichia coli carrying the plasmid containing phage T4 DNA polymerasegene
□ 제품설명
본 효소는 주형 DNA와 프라이머를 필요로 하여, 주형에 상보적인 nucleotide를 프라이머의 3’-OH 말단에 순차적으로 부가하는 반응을 촉매한다.본 효소는 Klenow Fragment에 비하여 약 100~1,000배 강한 단일가닥 DNA 특이적 3’→ 5’exonuclease 활성을 갖고 있으나, 5’→ 3’exonuclease 활성은 갖고 있지 않다. 3’→ 5’exonuclease 활성은 polymerase 활성의 약 3배 turnover number를 갖고 있어 통상의 조건에서 이중가닥 DNA 말단의 분해도 가능하다.dNTP가 존재하는 통상의 조건에서는 polymerase 활성을 나타내나, 말단합성 종료 후, dNTP가 고갈된 시점에서 DNA의 분해반응으로 바뀐다.3’→ 5’Exonuclease 활성에 의한 단일가닥 DNA의 분해활성은 사슬의 길이에 의존하여, 길이가 10배로 되면 (예 : 300 → 3,000 bp) 분해속도는 1/100이 된다. E. coli DNA polymerase I과 달리 nick으로 부터의 합성은 불가능하지만 T4 gene 32 산물을 첨가하면 가능해진다(저이온 농도). Polymerase 활성에 비하여 exonuclease 활성은 쉽게 온도의 영향을 받으므로 합성반응은 저온에서 장시간 하는 것이 좋다. 본 효소는 DNA 2차 구조의 영향을 받기 쉽고 T4 gene 32 산물의 도움없이는 2차 구조를 넘어서 계속 합성하기 어렵다. 반대로 두가닥 부분까지 합성이 진행되면 그 부분에서 반응이 정확히 정지하는 것으로 알려져 있다.
□ 활성의 정의
열변성 송아지 흉선 DNA를 주형/프라이머 로써 사용하여 37℃, pH8.8 조건에서 30분 동안 모든 10 nmol의 모든 뉴클레모티드를 산불용성 침전물의 합성기질로 사용하는 것을 효소활성 1 U으로 한다.
□ 활성 측정용 반응액 조성
| 67 mM | Tris-HCl (pH8.8) |
| 6.7 mM | MgCl2 |
| 16.6 mM | (NH4)2SO4 |
| 10 mM | 2-Mercaptoethanol |
| 6.7 μM | EDTA |
| 0.0167% | BSA |
| 0.2 mg/ml | 기질 DNA |
| 각 330 μM | dCTP, dATP, dGTP |
| 330 μM | [3H]dTTP |
□ 순도
2 U의 본 효소와 1 ㎍의 closed circular (RFI) pBR322 DNA를 37℃, 16시간 반응하여도 DNA의 전기영동 패턴에 변화가 일어나지 않는다.
□ 사용상의 주의
- pH7.5 와 pH9.7에서는 50%의 활성을 나타낸다.- 활성의 발현에 Mg2＋을 요구하며, 최대활성을 나타내기 위해서는 SH 환원제를 요구한다.- 반응계 전체의 이온농도가 100 mM를 넘으면 저해된다.- 주형 DNA의 고차구조의 영향을 받기 쉽고, T4 gene 32 산물에 의해 polymerase 활성은 현저히 활성화되지만 3’→ 5’
exonuclease 활성은 완전히 저해된다.- 10× 첨부 버퍼에 0.1% BSA를 직접 첨가하면 다량의 백색 침전이 생기므로 반응액을 조제할 때는 다음의 순서로 시약을
첨가한다. dH2O → 10× 첨부 버퍼 → 0.1% BSA → 기질 DNA
