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제품특징
□ 제품설명
본 제품은 주로 동.식물성polyA+ RNA부터 두 가닥 cDNA를 합성하기 위한 키트이다.본 키트의 구축은 Gubler-Hoffman의 방법1)에 기초한다. 시스템 원리는 이하 그림 참조(그림 1,2참조).
● PrimeScript RTase와 Oligo(dT)18 Primer 또는 Random Primer를 이용해 1st strand cDNA를 합성한다.
● E. coli RNase H로 mRNA-cDNA hybrid의 RNA에 nick을 넣고, E. coli DNA Polymerase I과 E. coli DNA Ligase의
시스템에 의해 RNA를 DNA로 교체하면서 2nd strand DNA를 합성한다.
● T4 DNA Polymerase로 말단의 평활화를 실시한다.
□ 내용 (10 회)
PrimeScript RTase(200 U/μl) | 10 μl |
RNase Inhibitor(40 U/μl) | 10 μl |
Oligo (dT)18 Primer(1μg/μl) | 20 μl |
Random Primer(9 mer)(0.3μg/μl) | 20 μl |
5×1st Strand Synthesis Buffer | 40 μl |
dNTP Mixture(각 10 mM) | 40 μl |
E. coli RNase H / E. coli DNA Ligase Mixture | 20 μl |
E. coli DNA Polymerase I(20 U/μl) | 20 μl |
5×2nd Strand Synthesis Buffer | 300 μl |
T4 DNA Polymerase(1 U/μl) | 40 μl |
RNase free dH2O | 600 μl×2 |
Control RNA(1μg/μl)* | 5 μl |
* 본 키트에 첨부된 Control RNA는 SP6 promoter영역의 하류에 pBR322 유래의 테트라사이클린내성유전자를 포함 약 1.4 kb의 단편을 삽입한 plasmid pSPTet3을 template에 SP6 RNAPolymerase를 사용하여 invitro transcription에 의해 합성한 것이다. 이 Control RNA는 30개의 adenine염기로 된 polyA+ tail을 가진 약1.4 kb의 polyA+ RNA로 이 RNA를주형에 두 가닥 cDNA를 합성해 적절한 plasmid에삽입했을 때 이 두가닥 cDNA가 full-length의것이라면, 이 plasmid는 테트라사이클린 내성이다.
□ 보존
- 20℃
□ cDNA합성의 원리
그림 1. Oligo(dT)18 Primer를 이용한 두 가닥 cDNA합성 반응
그림 2. Random Primer를 이용한 두 가닥 cDNA합성 반응
