□ 특징

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● 목적 단백질의 발현 수준을 정밀하고 신속하게 직접 조절

● 단일 vector 시스템

● 많은 세포와 단백질에서 검증된 시스템

● 어떤 promoter와도 함께 사용 가능

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□ 간편하고 효과적인 기술

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ProteoTuner system은 목적 단백질을 in vivo에서도 신속하게 직접 조절 가능한 매우 독창적인 기술이다. 단백질 기능 연구를 위한 강력한 이 기술은 2 가지 핵심 요소로 구성 되어 있다.

● 12 kDa destabilizing domain (DD)이 목적 단백질과 융합 발현되면 단백질을 불안정화시켜 proteosomal degradation

과정으로 유도한다. DD coding sequence는 vector의 multiple cloning site (MCS)에 인접하여 존재한다.

● Shield1은 세포막 투과성이 있는 750 Da의 작은 molecular ligand로 DD와 융합된 단백질이 분해되지 않도록 보호한다.

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Shield1은 DD 융합 단백질을 안정화시켜 "protein on" 상태로 유도하여 세포 내에 단백질이 축적되도록 한다. 이 안정화는 단지 15 분~30 분 정도의 짧은 시간 안에 이루어진다 (1). 그러나 배지교환을 통해 Shield1을 배지에서 제거하면 세포 내에 축적되어 있던 DD 융합 단백질은 빠르게 분해되어 "Protein off" 상태가 된다.따라서 Shield1의 농도 조절을 통해 세포 내 목적 단백질의 안정화를 조절하여 단백질의 발현 양을 조절할 수 있으며, 단백질 발현의 on/off 과정은 가역적이며 반복적으로 조절이 가능하다.

Figure 1. Ligand-dependent, targeted and reversible protein stabilization. A small destabilization domain (DD; blue) is fused to a target protein of interest. The small membrane-permeant ligand Shield1 (red) binds to the DD and protects it from proteasomal degradation. Removal of Shield1 causes rapid degradation of the entire fusion protein. The default pathway for the systems is degradation of the fusion protein, unless Shield1 is present.

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□ 다양한 분야에 적용 가능한 시스템

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● 세포내 도입 방법 : ProteoTuner system은 lentivirus 용이나 retroivirus 용 그리고 일반적인 plasmid 형태로 구성되어 있으며,

transfection control로 형광단백질을 발현할 수 있는 형태와 발현할 수 없는 형태로 구성되어 있다.

● DD 서열의 융합부위를 N-말단 또는 C-말단 선택 : ProteoTuner system은 DD domain이 N-말단에 융합되거나 C-말단에

융합되는 2 가지 형태로 제공되고 있으므로 실험에 따라 적절한 DD 사용이 중요하다. DD-C (ProteonTuner C system)는 C-terminal tag로 적합하고 일반적인 DD는 N-terminal tag를 이용하는 것이 적합하다.

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□ 단백질 발현 수준을 조절하면서 항체나, Chemiluminescent tag으로 관찰

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● DD Monoclonal Antibody는 N-말단과 C-말단의 DD를 특이적으로 검출할 수 있다. Western blot이나

immunocytochemistry로 세포 용해 후 융합 구조를 식별하고 확인할 수 있다. Antibody는 DD-AcGFP1을 일시적으로

transfection 한 10,000 개 이하의 세포에서도 DD-tag 단백질을 검출 할 수 있을 정도로 매우 민감도가 높다.

● ProteoTuner Quantitiation System에 포함된 vector는 DD-tag (발현조절)와 ProLabel-tag (정량)를 가지고 있다.

이 vector의 multicloning site (MCS)에 목적 단백질을 발현하는 유전자를 cloning하면 N-말단에 DD coding sequence와

C-말단에 6 kDa의 ProLabel-tag가 결합된 단백질이 발현된다. DD로 조절되는 단백질의 발현 정도는 ProLabel 검출

시약으로 쉽게 검출할 수 있다.

Figure 2. Easy detection of DD fusions with the DD Monoclonal Antibody. Cell lysates from HeLa cells transiently expressing either DD-AcGFP1 or AcGFP1-DD, and HEK 293 cells stably expressing DD-AcGFP1, were analyzed by Western blot using the DD Monoclonal Antibody at a 1:500 dilution. Lane 1: HeLa cells transfected with pDD-AcGFP1 (e.g., DD-N).Lane 2: Negative control (untransfected HeLa cells). Lane 3: HeLa cells transfected with pAcGFP1-DD (e.g., DD-C). Lane 4: Negative control (untransfected HEK 293 cells). Lane 5: HEK 293 cells stably expressing DD-AcGFP1.

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□ 유도발현의 이중 조절

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pTRE-Cycle Vector는 다수의 단백질 발현을 이중으로 조절 가능하다 (Figure 3). 우선 DD로 융합된 목적 단백질은 Tet-inducible system에 의한 전사 조절과 ProteoTuner system에 의한 단백질 분해 조절을 통하여 이중으로 발현이 조절되며, 다른 또 하나는 목적 단백질이나 형광 단백질 (mCherry 또는 ZsGreen1)은 Tet-inducible expression 만으로 발현을 조절한다.

Figure 3. pTRE-Cycle Vectors for two-tiered expression control. pTRECycle1 allows you to coexpress two proteins of interest-one with a DD tag and one without. pTRE-Cycle2 and pTRE-Cycle3 allow you to inducibly coexpress a red or green fluorescent protein along with your DD-tagged protein of interest.

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□ Components & Storage Conditions

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각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.

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□ References

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1. Banaszynski, L. A. et al. (2006) Cell 126(5):995-1004.