摘要

本文对近期涉及悬浮哺乳动物细胞生产重组蛋白的文献进行综述。我们介绍了两种构建稳定细胞系的方法，分别为使用转座子和慢病毒载体构建，产生非靶向外源基因整合；另一种方法是使用位点特异性重组酶，使外源基因靶向整合。传统构建细胞系的方法是通过非同源DNA末端连接的方法构建质粒后转染细胞，而本文介绍的方法所获得的细胞系，其蛋白质产量通常优于通过传统方法建立的细胞系。此外，这些技术还可以用于稳定细胞池的构建，以及通过基因转移和基因筛选的原理获得重组细胞的异源种群，而不需要做单克隆筛选。这些技术大大地缩短从转基因到获得蛋白质的时间。

背景介绍

当我们想用哺乳动物细胞生产重组蛋白用于结构学研究时，首先想到的办法是将外源基因通过瞬时转染的方法转染到人胚胎肾293细胞（humanembryonickidney293cell，HEK293）中。悬浮培养的HEK293能迅速及高产地表达外源基因，获得大量的外源蛋白（图1）。在进行转染操作时，质粒DNA的量需要超过1mg/L。虽然研究者尝试着在保持高蛋白产量的同时减少质粒DNA的量，但当需要大量培养细胞时，质粒DNA的制备仍是一大障碍。因此，在设计实验时就应充分考虑这个问题。构建可稳定表达外源基因的重组细胞系是可替代蛋白瞬时表达的方法，其优势在于大大减少了对质粒的需求量；易于扩大培养；以及可通过建立冷冻细胞库而获得可长期使用的重组细胞系。而构建这种重组细胞系主要的不足之处在于耗时较长（图1）。正如图中展示的基因转移方法，目前表达蛋白质最佳的方法是构建一个稳定的细胞池，而不是构建一个克隆细胞系（图1）。本方法省去了单细胞克隆和细胞系筛选等步骤，这两个步骤正是构建细胞系中耗时最长的步骤。此外，我们还对构建细胞系和细胞池的最新进展进行了总结，并简要概述了哺乳动物细胞悬浮培养的方法和用于基因稳定表达的载体的设计方法。另外，有几篇综述介绍了已在哺乳动物细胞中通过稳定或瞬时基因表达获得的蛋白质的研究信息。

图1悬浮培养哺乳动物细胞中外源基因稳定和瞬时表达的策略

（基因瞬时表达的关键步骤是将一个或多个表达载体转染到细胞中。在后续的生产期（1~10天）内细胞都悬浮于培养液中。基因稳定表达同样需要将一个或多个表达载体转染到细胞中，随后需要对细胞进行为期1~2周的筛选过程。经过筛选的重组细胞可直接构建一个细胞池用于蛋白质的生产，或继续进行单细胞克隆构建稳定细胞系。在没有选择性压力的情况下，可在多个克隆细胞株中筛选得到一个或多个蛋白质产量高、悬浮状态下生长状况好、蛋白产量稳定的细胞株。可将筛选得到的某个克隆细胞系用于重组蛋白的生产。无论是使用转座子、慢病毒载体或重组酶将重组基因整合到宿主基因组中，构建稳定细胞系和细胞池的时间是大致相同的。使用靶向整合或非靶向整合技术均可提高构建细胞系的效率，因为这些方法减少了克隆细胞系的个数，减轻了筛选工作的负担。此外，使用这些转基因方法构建细胞池可快速、经济高效地生产蛋白质。）

宿主细胞以及悬浮培养条件

基因稳定表达技术最常用的宿主细胞是可悬浮培养的HEK293细胞和中国仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovarycells，CHO）。主要原因包括这两种细胞悬浮培养条件下细胞密度较高；易于转染；对培养基要求较低，可用多种商业化的无血清培养基进行培养；有糖基化缺陷型细胞株（HEK293S-GnTI—、HEK293GlycoDelete、和CHO lec1）便于后续操作；可使用过度表达四环素抑制子（tetracyclinerepressor，TetR）的细胞株（T-Rex®-293和T-RexTM-CHO）对外源基因进行诱导表达；可使用特殊的细胞株（Flp-InTM-293、Flp-InTM、T-REx®-293和Flp-InTM-CHO）用于外源基因的靶向整合等。另外还有一些细胞系也可悬浮培养，如Hela细胞、幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney，BHK）以及人PER.C6细胞等，接下来介绍的稳定细胞系的构建方法也可用于这些宿主细胞。

根据我们的研究经验，当目的蛋白为跨膜蛋白和分泌蛋白时，使用CHO构建稳定细胞系的效率较HEK293高。此外，由于CHO是大规模生产治疗性蛋白的主要宿主细胞，因此，相关研究人员希望通过宿主工程提高蛋白的产量。为了优化细胞生长状况和存活率，可通过mTOR或抗细胞凋亡蛋白Bcl-XL的过度表达，分别获得较高产量的重组抗体或细胞表面受体。靶向于蛋白分泌途径可提高分泌蛋白的产量，过表达转录因子YY1可在多个HEK293和CHO株中获得较高产量的重组抗体。另外，过表达或抑制特定的CHOmicroRNAs（miRNAs）都可提高分泌蛋白的产量。最近有研究表明，可使用诱导型转基因表达的载体及可通过RNA干扰技术抑制多个细胞靶基因的多种短发夹RNA的组成型过表达，达到改造宿主细胞的目的。

对于HEK293和CHO细胞悬浮培养的条件，大多数实验室使用的摇瓶为锥形瓶、圆形或方形的玻璃瓶，以及Nalgene的大玻璃瓶。此外，还可使用TubeSpin®生物反应器。生物反应器盖子带有透气性滤膜，容量有50mL或600mL两种，工作体积分别为2-20mL和100-500mL。最近有报道介绍了可用50L和200L的一次性生物反应器进行10-200L的细胞培养。另外，还可选择WAVE的一次性摇袋式生物发应器，其培养体积至少为100mL。

表达载体的元件

构建稳定细胞系技术最有可能出现的问题是外源基因的沉默，因此细胞需要在没有选择性压力的情况下培养数周才能表达蛋白。虽然大多数哺乳动物表达载体所采用的是人巨细胞病毒极早期启动子/增强子（human cytomegalovirus major immediate early promoter/enhancer，hCMV-MIE），但这并不是构建稳定基因表达细胞系技术的最佳选择，因为它在许多细胞系（如CHO）中易受基因沉默的影响。在表达载体中加入其他元件，如核基质相关区（matrixassociated region，MAR）、泛染色质开放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element，UCOE）或其它绝缘体元件，均可降低基因沉默的风险。除了hCMV-MIE以外，也可以使用小鼠巨细胞病毒极早期启动子/增强子（mouse cytomegalovirus major immediate early promoter/enhancer，mCMV-MIE）、人延伸因子-1α启动子（human elongationfactor-1 alpha promoter，hEF-1α）和SV40早期启动子/增强子（SV40early promoter/enhancer，SV40E）等强启动子。根据我们的研究结果，当使用mCMV-MIE为表达载体时，转座子介导的外源基因在CHO衍生细胞系和细胞池中均能稳定表达。

若需在稳定细胞系的表达载体中加入蛋白诱导元件，Tet-On是首选。这种方法通常仅用于细胞内蛋白和跨膜蛋白的表达，如在多种HEK293细胞株的染色体中过表达G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCR）和配体门控离子通道。鉴于Tet-On的工作原理，要求宿主细胞必须稳定并组成性表达TetR。如前文所述，目前可用的细胞系有HEK293和CHO。几乎所有带有Tet-On系统的表达载体都具有受控于hCMV-MIE的转基因，即多个拷贝的TetR结合位点——Tet操纵子（Tetoperator，TetO）。当在培养基中加入四环素（tetracycline，Tet）或多西霉素（Doxycycline，Dox），与TetO结合的TetR被抑制，下游基因开始转录。正如前面所言，hCMV-MIE容易基因沉默。在这一点上，通过添加丁酸钠——组蛋白脱乙酰酶抑制剂，可提高HEK293细胞中Tet-On系统控制下的小鼠5-HT3受体的表达量。此外，还可以在表达载体上引入MAR或UCOE元件达到减弱基因沉默的目的。另外，还可以选择其他的诱导型启动子。

非靶向基因整合转座子

几个天然存在的转座子，包括PiggyBac（PB）、SleepyingBeauty（SB）、Tc1/mariner家族的Mos1、青鳉Tol2转座子等，都经改造使其可用于哺乳动物细胞中。这些二类转座子是由转座酶基因和两端的末端重复序列组成的。末端重复序列可被同源转座酶特异性识别，而后进行切割和连接反应，这是转座子从一个位置移动到另一个位置所必经的步骤。当使用以上列举的转座子作哺乳动物细胞的载体时，通常需要使用双载体系统（图2）。辅助载体由转座酶和一个组成型的强启动子组成，而供载体则由末端重复序列、筛选基因以及一个或多个带有启动子的外源基因组成（图2）。适应于哺乳动物细胞的转座酶有利于转座于主动转录基因中或其附近。这可能在很大程度上归因于转座子产生的细胞系的特殊生产力和长期稳定性。

图2哺乳动物细胞中基于转座子的转基因技术原理图

（PB、SB、Tol2等二类转座子通用的双载体转基因系统如图所示。辅助载体和一个或多个供载体一起共转染到宿主细胞中，其中辅助载体可瞬时表达转座酶（transposase，TPase），而供载体带有一对反向末端重复序列（invertedterminalrepeats，ITRs）、一个目的基因（geneofinterest，GOI）或两个不同的带有各自启动子（promoter，P）的目的基因（GOI-A和GOI-B）。每一个供载体都有一个筛选标记（selectionmarker，SM）。筛选标记通常接于一个弱启动子之后，与GOI进行区分，增加筛选到高产重组细胞的概率。一个或多个供载体可在辅助载体的帮助下共转染到细胞中。瞬时表达的TPase可将来自于供载体的每个转座子都整合到宿主细胞基因组中。转染后的细胞经筛选后可用于稳定细胞池和稳定细胞系的构建，如图1。）

PB是构建稳定细胞系实验中最为常用的转座子，已成功在CHO、CHO lec1、HEK293和HEK293S-GnTI细胞中过表达分泌蛋白和跨膜蛋白。由于用PB系统进行转染能产生较多的重组细胞，因此也可通过PB系统构建生产性细胞池。使用SB或Tol2都可获得高产的CHO细胞系和细胞池。此外，SB和PB还被用于构建含有Tet-On诱导表达系统的细胞系。尽管在没有选择压力的情况下，PB衍生的细胞系仍具有相当恒定的蛋白质生产水平，但是在供载体上添加MAR元件可减少了基因沉默的作用。除了以上提到的转座子系统，还有一些商品化的系统，如Leap-InTM（DNA 2.0，Menlo Park，CA）。有实验证明，使用PB系统可同时转多个基因，可在稳定的CHO和CHO lec1细胞系中表达有活性的γ-分泌酶（4个亚单位），也可在稳定HEK293细胞系中表达电压门控钠离子通道（3个亚单位）。在这些例子中，均同时用两个供载体共转染到宿主细胞中，每个载体均带有各自的筛选标记以及一个或两个外源基因。

慢病毒载体

与转座子类似，慢病毒载体倾向于把外源基因整合到转录活性较高的基因中。另外，通过改变感染复数（multiplicityofinfection，MOI）可在一定程度上调节每个细胞中整合载体DNA的数量。慢病毒载体的一些不足之处限制了它在蛋白质表达技术上的应用。首先，构建载体除了需要较长的时间以外，还需要在二级生物安全环境中构建和进行宿主细胞的感染。此外，质粒转染后的病毒基因组在逆转录过程中容易出现基因突变。即使慢病毒载体在诱导型和组成型启动子的控制下，在CHO、BHK和HEK293细胞系中均可进行高效的蛋白质表达，但基于以上原因，慢病毒载体并不被重用。大多数情况下，外源基因受控于hCMV-MIE或一个细胞内的强启动子。但是，在一个足够高的感染复数条件下，慢病毒载体可感染培养液中几乎所有的细胞并在细胞中进行整合，因此，这种转基因方式也是构建细胞池的理想方法之一。

靶向基因整合

靶向基因整合主要方法是使用酵母Flp重组酶或噬菌体Cre重组酶进行重组酶介导的盒式交换（recombinase-mediatedcassetteexchange，RMCE）。使用以上两种酶进行重组时，宿主细胞需分别用一对Flp-重组酶标记序列（Flp-recombinasetarget，FRT）或lopxP位点进行标记，此外还需要使用一个报告基因对重组细胞进行\"报告”（图3a）。随后将可瞬时表达重组酶的载体和携带有外源基因及第二个报告基因的载体共转染到已标记好的细胞系中，进行RMCE（图3a）。这个系统可以保证获得的重组细胞系基因组中只有一个外源基因的拷贝，且整合到转录活动较为活跃的位点。最近，有研究在克隆CHO细胞系中通过RMCE技术过量表达了几种不同的抗体和GPCR。还可在进行共转染和宿主细胞的筛选后，通过RMCE技术构建稳定的细胞池。

基于Flp的靶向整合技术称为重组酶介导的DNA插入（recombinase-mediatedDNAinsertion，RMDI），可与市售的FLP-InTM细胞配合使用。这种宿主细胞基因中带有一个FRT位点和报告基因（图3b）。RMCE技术要求DNA序列位于载体两个FRT位点之间，才能整合到靶位点（图3a），而与RMCE不同，RMDI技术可将整个质粒整合到靶位点（图3b）。考虑到细菌DNA序列中GC含量较高，细菌DNA元件易受DNA甲基化影响而在RMDI操作中出现问题。最近，有研究通过RMDI技术在Flp-InTM-293细胞中系成功地过表达核孔复合物亚基，以及在Flp-InTM-CHO细胞中表达P2Y12受体。

已有研究构建了具有两个不同重组位点（双重RMCE）的宿主细胞，用于在单个细胞系中过表达多个外源基因。通过Flp重组酶将这一策略用于N1H3T3细胞和CHO lec3.2.8.1细胞中，或通过两种噬菌体重组整合酶的使用用于CHO细胞。这种方法可通过单次转染或两次连续转染而产生过表达多个外源基因的稳定细胞系。

此外，使用CRISPR / Cas9 RNA介导核酸酶进行外源基因的靶向整合，可用于表达重组蛋白的稳定CHO和HEK293细胞系的构建。尽管这种技术只能用过表达荧光蛋白的细胞系进行验证，但是在某种意义上它不需要对宿主细胞进行标记，因而简化了基因靶向整合的过程。还有一些研究使用CRISPR/ Cas9和锌指核酸酶来构建可研究糖基化途径的CHO细胞。

图3使用Flp重组酶进行重组酶介导的盒式交换和DNA插入技术进行靶向整合的原理图

（（a）对于RMCE，需要将可瞬时表达Flp重组酶的载体和携带有GOI的载体共转染到标记的宿主细胞中，通过一对FRT/FRT’进行盒式交换。载体还带有一个启动子和一个ATG密码子用于与宿主基因组标记位点处的缺失型B报告基因（△reporterB）融合表达。RMCE技术前后整合位点的结构如图所示。（b）对于RMDI，将可瞬时表达Flp重组酶的载体和携带有GOI、单一FRT序列和一个没有启动子的报告基因的载体共转染到标记的宿主细胞中。RMDI技术前后整合位点的结构如图所示。要注意的是，RMDI前，A报告基因处于失活状态，只有在整合后才能受启动子的调控。）

总结

十九世纪八十年代中期，自从重组哺乳动物细胞系第一次被报道，细胞系的构建得到广泛的发展。如本文所介绍的转基因技术，细胞系的构建不再依赖于外源基因非同源重组整合到宿主基因组中。现今，可利用转座酶、整合酶和重组酶等，大大地提高了构建细胞系的效率。当需要用稳定细胞系或细胞池进行生产时，转基因的方法的选择主要取决于是需要单拷贝外源基因重组到特定位点的细胞系，还是整合了多个、非靶向外源基因的细胞系。将来，CRISPR/Cas9将会是靶向基因整合构建细胞系的有效方法之一。本文所描述的转基因方法可有效构建生产性重组细胞系，此外，还可用于细胞池的快速构建。细胞池是除了稳定细胞系和瞬时基因表达以外的蛋白质表达手段。未来几年，对重组蛋白生产的主要宿主细胞进行基因组学和代谢组学的研究，有望在宿主细胞工程方面取得快速进展，使得我们获得更可行、更高效的重组细胞系和细胞池。由于哺乳动物细胞固有的遗传和表观遗传不稳定性，导致培养的哺乳动物细胞群体存在异质性，这也是未来我们需要努力克服的主要障碍。

参考文献：

Hacker DL,Balasubramanian S.Recombinant proteinproductionfromstablemammaliancell linesandpools.Curr Opin Struct Biol.2016 Jun;38:129-36.

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