Un rol esențial pentru tagln2 în fagocitoza macrofagelor activate cu lipopolizaharide | rapoarte științifice - Rapoarte științifice - 2020Aprilie 2020SubiecteInfectie cu bacteriiMacrofage peritonealeAbstract

Macrofagele activate au o capacitate mai mare de fagocitoză împotriva agenților patogeni care este mediată de rearanjarea actinelor pe scară largă. Cu toate acestea, mașinile moleculare care conduc această sarcină nu au fost pe deplin identificate. Aici, demonstrăm un rol neașteptat al TAGLN2, o proteină de legare a actinei de 22 kDa, în fagocitoza stimulată de receptorul Toll-like (TLR). TAGLN2 a fost puternic indus în macrofage ca răspuns la lipopolizaharidă (LPS), ligand pentru TLR4, parțial prin calea NF-kB. TAGLN2-deficiente macrofage ( TAGLN2 - / - ) a aratat functii fagocitare defecte de IgM si IgG-acoperite cu celule rosii de oaie, precum si bacterii. Căile de semnalizare celulare implicate în rearanjarea actinei - kinaza PI3 / AKT și Ras-ERK - au fost, de asemenea, reglate în jos în macrofagele cu deficit de TAGLN2 stimulate cu LPS. Mai mult decât atât, șoarecii TAGLN2 - / - au prezentat o mortalitate mai mare după infecția bacteriană decât cele de tip sălbatic. Astfel, rezultatele noastre au relevat o nouă funcție a TAGLN2 ca armament molecular necesar pentru apărarea gazdei.

Introducere

Infecția bacteriană este o cauză comună a sepsisului și a insuficienței de organe asociate cu sepsis, care determină o morbiditate și o mortalitate ridicată 1 . În ciuda progreselor moderne în îngrijirea critică, patogenia acestui agent patogen devastator rămâne neclară. Macrofagele sunt prima linie de apărare a gazdei împotriva agenților patogeni și fagocitoza este una dintre cele mai importante răspunsuri imune inițiale. Pacienții cu defecte fagocitare cunosc de obicei diseminarea precoce a infecției, ducând la sepsis sever și creșterea mortalității 2 . Mai mult, activitatea fagocitară redusă în primele 24 de ore după admitere a fost recunoscută ca un predictor negativ pentru supraviețuirea pacienților septici 3 .

Macrofagele pot fi activate de citokine precum IFN-y sau endotoxine bacteriene, cum ar fi lipopolizaharidă (LPS) 4 și macrofagele activate au o capacitate mai mare de fagocitoză împotriva agenților patogeni opsonizați cu complement și imunoglobulină. În timpul clearance-ului agenților patogeni, la legarea receptorului mediată de țintă, PI3 kinazele (PI3K) și AKT kinazele (AKT) sunt activate și necesare pentru reorganizarea dinamică și rapidă a citoscheletului actinic 5, 6, 7 . Citoscheletul actinic de polimerizare mediază proeminențele sau rufele membranei macrofage care poate internaliza agenții patogeni țintă. În acest proces, un număr mare de proteine ​​actin-reglatoare, care sunt responsabile pentru nucleare, separare sau depolimerizare, grupare și reticulare, participă la remodelarea actinei 8 . Cu toate acestea, mașinile moleculare care reprezintă capacitatea crescută a fagocitozelor în macrofagele activate în comparație cu macrofagele de repaus sunt relativ necunoscute.

Transgelin (TAGLN), o proteină de legare a actinei de 22 kDa, a fost descoperit pentru prima dată în mușchiul neted al puiului de găină (SM22) cu funcție necunoscută 9 și, ulterior, a fost denumit transgelin datorită proprietăților sale de sensibilitate la transformare, 10 . Pe lângă TAGLN1 (cunoscut și ca SM22α), două dintre izoformele sale - TAGLN2 (SM22β) și TAGLN3 (NP25) - au fost identificate la om cu o omologie de secvență de aminoacizi de aproximativ 70%. Ambele izoforme, în mod similar cu TAGLN1, sunt asociate cu filamente de actină, dar diferă în specificitatea expresiei de tip celular. TAGLN1 este cel mai bine caracterizat ca un marker timpuriu al diferențierii mușchiului neted 11, 12 . Ablația TAGLN1 la șoarece reduce contracția vasculară ca răspuns la depolarizare și este implicată în procesul bolilor arteriale 13 . TAGLN1 este, de asemenea, considerat un supresor tumoral, deoarece pierderea expresiei sale este un eveniment precoce în transformarea celulelor și dezvoltarea unor tumori 14 . TAGLN3 participă la evoluția creierului și influențează creșterea neuritului 15 . Nivelul TAGLN3 este legat de modificările neuropatologice ale creierului alcoolic și schizofrenic 16 . Rapoartele proteomice recente demonstrează că TAGLN2 este crescut în anumite tumori, inclusiv colorectal 17, hepatocelular 18, sân 19 și cancer pulmonar 20, sugerând astfel un rol în progresia tumorii sau în metastaze. Cu toate acestea, comparativ cu TAGLN1 și 3, funcția TAGLN2 în procesele celulare normale este relativ necharacterizată.

Recent, am raportat că TAGLN2 este exprimat predominant în celule T și stabilizează actina filamentoasă (F-) cortică, menținând astfel conținutul de F-actină la sinapsei imunologice, care permite celulelor T efectoare să ucidă eficient celulele canceroase 21 . Mai mult, am descoperit că TAGLN2 în celulele B mediază, de asemenea, stabilizarea sinapselor 22 . Spre deosebire de celulele T și B, cu toate acestea, macrofagele fie derivate din cavitatea peritoneală, fie din măduva osoasă exprimă un nivel foarte scăzut al TAGLN2, sugerând funcția minimă a acesteia în macrofagele de repaus. În mod surprinzător, totuși, am constatat că TAGLN2 este indusă în mare măsură de lipopolizaharidă (LPS) - un ligand pentru TLR4 - care, de asemenea, mărește polimerizarea cu actină. Acest fapt ne-a determinat să investigăm dacă TAGLN2 corespunde rearanjării actinice dinamice, și astfel proeminența membranei sau rufării în macrofagele activate. Aici, am demonstrat că TAGLN2 a mediat dinamica actinelor la scară largă în timpul acaparării bacteriilor, mărind astfel fagocitoza și că reglarea fagocitoză de către TAGLN2 a jucat un rol esențial în apărarea gazdei împotriva infecțiilor bacteriene.

RezultateTAGLN2 este supra-indus ca răspuns la LPS în macrofage

Anterior, am raportat că TAGLN2 este foarte exprimat în țesuturile imune, cum ar fi timusul, splina și ganglionii limfatici 21 . Mai mult, este constitutiv exprimată în celule T primare (CD3 +, CD4 + și CD8 + ) și B (CD19 + ) (Fig.1a). Spre deosebire de celulele limfoide, am observat că macrofagele derivate din măduva osoasă sau din peritoneu exprimă niveluri minime ale TAGLN2 (figura 1a și figura complementară S1a și b), sugerând că are o funcție minimă în macrofagele de repaus. În mod surprinzător, macrofagele tratate cu IFN-y și LPS au exprimat TAGLN2 înalt, dar nu și alți membri ai familiei TAGLN (Fig.1b), sugerând o funcție unică a TAGLN2 după infecția bacteriană. Studiu suplimentar a demonstrat că expresia TAGLN2 a fost indusă ca răspuns la LPS, dar nu la IFN-γ (Figura 1c). Pentru a înțelege semnalele potențiale care mediază inducerea TAGLN2, au fost utilizați doi activatori farmacologici. Interesant, TAGLN2 a fost indus semnificativ după tratamentul cu 12-miristat 13-acetat de forbol (PMA), un activator al proteinkinazei C (PKC) și ușor indus după tratamentul cu A23187, un ionofor de calciu (Fig.1c), sugerând că PKC, și parțial semnalizarea calciului, sunt probabil implicate în expresia TAGLN2 mediată de LPS (Figura 1c). Analiza timpului a demonstrat că inducerea TAGLN2 de mRNA prin LPS a precedat expresia proteinei (Fig.1d). De asemenea, am utilizat inhibitori farmacologici diferiți pentru a determina calea (căile) de semnalizare care reglează expresia TAGLN2. După cum se arată în figura 1e, expresia TAGLN2 indusă de LPS nu a fost modificată după pretratarea cu inhibitori ai kinazei p38 (SB203580), JNK (SP600125), ERK (PD098059) și PI3 kinază (LY294002) la concentrația care a blocat fosforilarea proteinele țintă (datele nu sunt prezentate). Am determinat în continuare factorii de transcriere care au fost implicați în reglarea expresiei TAGLN2. În timp ce SR, un inhibitor AP1, nu a afectat expresia TAGLN2, CsA, un inhibitor al căii NFAT, a scăzut ușor expresia TAGLN2 ca răspuns la LPS (Fig.1e). Acest rezultat ar putea reflecta inducerea ușoară a expresiei TALGN2 ca răspuns la ionoforul de calciu, A23187 (Figura 1c). Interesant, inducerea exprimării TAGLN2 prin LPS a fost aproape complet suprimată după tratamentul cu inhibitori NF-kB, PDTC și Bay11-7082 (Fig.1e). Aceste rezultate au sugerat puternic că expresia TAGLN2 a fost influențată de calea NF-kB. Prin urmare, am analizat regiunea promotor din amonte a trei membri ai familiei TAGLN și am descoperit în mod interesant faptul că TAGLN2 conține numai motivul consensului NF-κB la regiunea amonte -174 ~ -179 (vezi figura suplimentară S2). În mod consecvent, mutația punctuală a acestei regiuni a redus semnificativ activitatea NF-κB luciferază (Fig.1f).

TAGLN2 este supra-indus ca răspuns la LPS în macrofage. ( a - e ) Analiza expresiei TAGLN prin western blot. ( a ) Exprimarea TAGLN2 în splenocite (spl), subseturile de celule T (CD3 +, CD4 + și CD8 + ), un subset al celulelor B (CD19 + ) și macrofagele (peritoneale, derivat, BMDM) purificat de la șoareci de tip sălbatic. Nivelele de exprimare TAGLN2 au fost cuantificate ca raportul la β-actină prin densitometrie. Rezultatele sunt reprezentative pentru trei experimente independente. Lamele / gelurile cu lungime întreagă sunt prezentate în figura suplimentară S5. ( b ) Exprimarea expresiei TAGLN1, 2 și 3 în macrofagele derivate din peritoneală și din măduva osoasă. Celulele A7R5, Jurkat T și lizatul creierului au fost utilizate ca martori pozitivi. Macrofagele peritoneale au fost stimulate pentru timpul indicat cu IFN-y și LPS, iar expresia TAGLN1, 2 și 3 și iNOS (un control pozitiv) au fost evaluate. Lamele / gelurile cu lungime întreagă sunt prezentate în figura suplimentară S5. ( c ) Macrofagele peritoneale au fost incubate cu diferite concentrații de LPS, IFN-y, PMA (activator PKC) și A23187 (activator de calciu) timp de 24 de ore. Lentile / gelurile cu lungime întreagă sunt prezentate în figura suplimentară S6. ( d ) Macrofagele peritoneale au fost tratate cu LPS (1 pg / ml) pentru momente diferite, așa cum este indicat. Western blot a fost realizat așa cum este descris în ( a ). Lentile / gelurile cu lungime întreagă sunt prezentate în figura suplimentară S6. Exprimarea mARN-ului TAGLN2 a fost cuantificată prin PCR cantitativ în timp real comparativ cu expresia mRNA GAPDH . Datele sunt prezentate ca expresia relativă medie ± SEM. * P 0, 05 vs. 0 timp. ( e ) Macrofagele peritoneale au fost pretratate timp de 30 minute cu diferiți modulatori de semnalizare (SB, SP, PD și LY (10 pM); SR (1 pM); CsA, PDTC și Bay (10 pM) stimulate suplimentar cu LPS timp de 24 de ore. Lentile / gelurile cu lungime întreagă sunt prezentate în figura complementară S7. ( f ) Activitatea promotorului TAGLN2 a fost analizată prin analiza reporterului cu luciferază utilizând ștergerea promotorului TAGLN2 sau construcții cu mutație punctuală. Toate fragmentele de promotor sunt indicate în partea stângă a graficului. Activitatea promotorului a fost analizată utilizând macrofage peritoneale în condițiile indicate.

Imagine de dimensiune completă

Fagocitoza defectuoasă în macrofagele de la șoareci TAGLN2 - / -

O posibilă asociere între semnalizarea TLR și fagocitoza a fost sugerată anterior 23 . În plus, evenimentele de semnalizare TLR sunt legate de dinamica citoscheletului actin 24 . Deoarece TAGLN2 este o proteină care leagă actina și a fost raportată că reglementează dinamica actinelor 21, 25, am examinat mai întâi dacă funcția TAGLN2 este legată de fagocitoza mediată de receptor. În acest scop, am utilizat macrofage obținute de la șoareci cu deficit de TAGLN2 ( TAGLN2 - / - ) 21 . Tulburările genei TAGLN2 și deficitul de proteine ​​au fost confirmate prin genotipare și Western blotting (figura 2a). Macrofagele peritoneale de la șoareci TAGLN2 + / + și TAGLN2 - / - au fost activate cu LPS timp de 24 de ore și apoi au fost provocate cu sRBCs opsonizat IgG sau IgM. TAGLN2 - / - macrofagele au fagocitosat mai puține sRBC decât TAGLN2 + / + macrofage în ambele căi mediate de FcγR și receptor (CR) (Fig.2b). Analiza cantitativă a sRBCs fagocitozate pe baza indicelui fagocitar este prezentată în figura 2c. Un proces de cuprindere prin micropinocitoză necesită, de asemenea, reorganizarea citoscheletului actinic. Apoi am determinat implicarea TAGLN2 în macropinocitoză folosind dextran. Absorbția dextranului de 70 kDa prin microfage în repaus în șoareci TAGLN2 - / - a fost semnificativ mai mică decât cea din contrapartidele lor de tip sălbatic (vezi Fig. Suplimentar S3). Așa cum s-a raportat mai sus 31, totuși, macropinocitoza a fost reglată în jos în macrofagele tratate cu LPS și, prin urmare, nu sa observat o diferență semnificativă în numărul de macropinozomi per celulă.

Fagocitoza defectuoasă în macrofagele de la șoareci TAGLN2 - / - . ( a ) genotiparea PCR. ADN-ul genomic a fost extras din țesutul urechii de șoarece. Alelele de tip sălbatic (+ / +) și heterozygote (+/-) au fost detectate cu primer (P1) care vizează EXON2, în timp ce alelele homozigote (- / -) nu au fost detectate cu acest primer. Folosind setul de primeri P2 (MC1-Neo), alelele heterozygote și homozigote, dar nu alela de tip sălbatic, au fost detectate. Proteina TAGLN2 din macrofage de la șoareci de tip sălbatic și TAGLN2 - / - a fost determinată prin analiză Western blot. Celulele izolate au fost stimulate cu LPS (1 pg / ml) timp de 12-24 ore. Rezultatele sunt reprezentative pentru trei experimente independente. ( b și c ) Fagocitoză mediată de FcγR sau CR în TAGLN2 - / - macrofage. Lamele / gelurile cu lungime întreagă sunt prezentate în figura suplimentară S8. ( b ) Macrofagele peritoneale de la șoareci de tip sălbatic și TAGLN2 - / - au fost activate cu LPS (1 pg / ml) timp de 24 de ore, incubate cu sRBC opsonizat IgG sau IgM, fixate și înregistrate la momente diferite de timp (IgG, 5 min; IgM, 30 min). Scară de bare, 5 μm. ( c ) Indicele fagocitar a fost calculat ca numărul de celule sRBC internalizate în 100 de macrofage. * P 0, 05 vs. macrofage de tip sălbatic. ( d ) Activitatea fagocitară in vivo . Exprimarea E. coli care exprimă GFP a fost injectată în peritoneul șoarecilor de tip sălbatic destinat receptorilor și TAGLN2 - / - . Funcția fagocitară a fost calculată prin citometrie de flux ca procentaj al GFP-pozitiv în celulele F4 / 80-APC. * P 0, 05, n = 10. Fagocitoză a E. coli care exprimă GFP în specii sălbatice și TAGLN2 - / - macrofage stimulate cu sau fără LPS timp de 24 ore. Imagistica temporizată a fagocitozei in vitro a E. coli care exprimă GFP a fost efectuată cu microscopie confocală (FV1000). Sunt afișate ultimele imagini statice selectate din filmele cu timp îndelungat (vezi secvențele video suplimentare S3-S4) (t = 900 s). Imagistica a început după adăugarea de E. coli care exprimă GFP. Scară de bare, 5 μm. Cuantificarea celulelor E. coli fagocitozate de către macrofage a fost reprezentată ca graf de bare. * P 0, 05, n = 6. ( e ) Macrofagele de la ( d ) au fost expuse la E. coli timp de 10 minute, fixate și prelucrate pentru SEM. Scară de bare, 5 μm. Fluorescența verde în figură a fost pseudo-colorată.

Imagine de dimensiune completă

Am evaluat în continuare fagocitoza bacteriilor vii ex vivo și in vivo . În acest scop, macrofagii peritoneali ( TAGLN2 + / + și TAGLN2 - / - ) au fost tratați cu sau fără LPS și apoi incubați cu bacterii vii transfectate cu GFP. TAGLN2 - / - macrofagele au arătat fagocitoză atenuată ( Fig.2d și Videoclipuri suplimentare S1-S4). Activitatea fagocitară ușor redusă în TAGLN2 - / - macrofagele de repaus a sugerat că un nivel de urmărire a TAGLN2 menține funcția fagocitară (Figura 2d). Analiza SEM a arătat că macrofagii de tip sălbatic stimulat de LPS au capturat eficient bacteriile infectante în mantale mari de membrană, în timp ce TAGLN2 - / - macrofagele au capturat un număr relativ mic de bacterii în mici volane (fig.2e).

TAGLN2 reglează polimerizarea actinei în macrofagele activate

Pentru a înțelege modul în care TAGLN2 reglează fagocitoza în macrofage, au fost studiate proprietățile TAGLN2 în legătură cu dinamica actinică. Macrofagele primare tratate cu LPS au fost fixate și colorate pentru TAGLN2 și F-actin. Am constatat că TAGLN2 sa acumulat intens la regiunea apicală bogată în F-actină cu membrană (Fig.3a). Pentru a examina dacă TAGLN2 afectează polimerizarea cu actină, macrofagii deficienți de TAGLN2 au fost stimulați cu LPS și apoi colorați pentru F-actin. După cum se arată în figura 3b, polimerizarea indusă de LPS a fost semnificativ redusă în macrofagele primare cu deficit de TAGLN2 ( TAGLN2 - / - ). Apoi am examinat dacă TAGLN2 acumulat afectează, de asemenea, polimerizarea actinică tranzitorie indusă de fMLP. Macrofagele de tip macrofage prealabile cu LPS au prezentat o polimerizare mai puternică a actinelor ca răspuns la fMLP decât macrofagii deficienți de TAGLN-2 (Fig.3c), sugerând că TAGLN2 joacă un rol important pentru dinamica citoscheletului actinic.

Impactul polimerizării cu actină în macrofagele cu deficit de TAGLN2. ( a ) TAGLN2 este localizat la manșeta de membrană bogată în actină. Macrofagele peritoneale proaspăt izolate au fost incubate cu sau fără LPS (1 pg / ml) timp de 24 de ore și au fost lipsite de ser timp de 3 ore. Celulele au fost tratate cu fMLP (200 nM) timp de 2 minute, fixate, colorate cu anticorp anti-TAGLN2 și TRITC-phaloidină și observate prin microscopie confocală. Scară de bare, 10 μm. S-au prezentat singure faze z în vederea bazală și dorsală, unde TAGLN2 și F-actin se colocalizează în maneci. Zonele în cutie (alb) sunt reprezentate ca imagini mărite în micrografurile corecte. ( b ) WT sau TAGLN2 - / - macrofagele au fost stimulate cu LPS timp de 24 ore și analizate pentru conținutul lor de actină și polimerizare prin citometru de flux microscopic confortabil (stâng) (dreapta) după colorare cu faloidină TRITC. Datele sunt reprezentate ca valoarea medie a intensității fluorescente (FI). ( c ) WT sau TAGLN2 - / - macrofagele au fost pretratate cu LPS timp de 24 de ore și apoi stimulate cu fMLP pentru perioadele de timp indicate. Actriminarea a fost analizată ca în figura c. ( d ) Acumularea de actină în stare de discontinuitate în cupele fagocitare în TAGLN2 - / - macrofage. Panourile de mijloc și de sus prezintă îmbogățirea cu F-actină în cupele fagocitare și, respectiv, formarea dinamică a rumenilor în timpul fagocitozelor. Săgețile indică cupele fagocitare care înconjoară sRBC. Scară de bare, 5 μm. ( e ) celulele RAW 264.7 au fost transfectate cu TAGLN2_GFP și LifeAct. La 24 de ore după transfecție, celulele au fost lăsate să fagocitoze cu granule acoperite cu IgG timp de 5 minute. Imaginile au fost capturate ca o serie T la fiecare 20 de secunde timp de 10 minute. Actin (roșu) și TAGLN2 (verde) au fost localizate pe fagozom și pseudopodia în stadiile foarte timpurii, cu cinetici similare. Sunt afișate ultimele imagini statice selectate din filmele cu timp îndelungat (consultați Video suplimentar S5).

Imagine de dimensiune completă

Etapa inițială de fagocitoză se crede că formează cesti fagocitari printr-un proces care implică polimerizarea actinei sub membrana plasmatică. În acest scop, macrofagele individuale de la șoareci TAGLN2 + / + și TAGLN2 - / - au fost incubate cu sRBCs opsonizat IgG și apoi s-au observat tiparele de F-actină. Structurile tip cupa bogate în F-actină au fost văzute clar în macrofagele de tip sălbatic. Cu toate acestea, în TAGLN2 - / - macrofage ( fig.3d) s-au găsit semnale F-actin mult mai puțin acumulate la regiunea de contact a sRBC . Aceste rezultate sugerează că TAGLN2 joacă un rol crucial pentru reorganizarea actinelor în macrofagele activate cu LPS. Pentru a observa asocierea actinei și rolul TAGLN2 în timpul fagocitozelor, a trebuit să vizualizăm actin și TAGLN2, simultan și live. În acest scop, celulele RAW 264.7 au fost co-transfectate cu TAGLN2 (TAGLN2_GFP) marcat cu GFP și LifeAct (LifeAct) cu marcă mCherry. Ca răspuns la bilele IgG opsonizate, TAGLN2 a fost foarte îmbogățit în jurul paharului fagocitar împreună cu semnalele LifeAct (Fig.3e și Video suplimentar 5). Aceste date au oferit dovezi suplimentare că TAGLN2 a contribuit la fagocitoză prin reglementarea actinelor.

TAGLN2 mediază perturbarea membranei în macrofagele stimulate cu LPS

Am investigat în continuare dacă dinamica actinică de către TAGLN2 este legată de formarea de maneci de membrană - o structură celulară importantă pentru fagocitoză sau macropinocitoză a substanțelor străine. Tipurile macrofagilor de tip macro ( TAGLN2 + / + ) au prezentat mai multe manșoane de membrană F-actin-pozitive după stimularea cu LPS / fMLP ( Fig.4a ), în timp ce TAGLN2 - / - macrofagele au prezentat plasturi limitate, localizate de ruffling cu mult mai mici phalloidin-TRITC intensitate (figura 4a). Analiza prin analiza citometrică a markerilor de suprafață a demonstrat că deficiența TAGLN2 nu a avut niciun efect asupra diferențierii macrofagelor (vezi figura suplimentară S4). Macrofagele de tip macrofag au prezentat cicluri de protuberanțe lamelipodiale și retracție și manșete de membrană fază-întunecată, producând kymografe care păreau a fi dealuri de rulare (fig.4b și video suplimentar S6-S7). Spre deosebire de acestea, macrofagii TAGLN2 - / - au prezentat o proeminență lamellipodială, retragere și o înfundare a membranei dense în fază, la o frecvență semnificativ mai mică, dând mai multe kimografe asemănătoare prairie (fig.4b). Analizele cu ajutorul kimografului și scanării liniare au arătat că viteza medie și distanța dintre proeminența și retragerea membranei sunt în mod semnificativ scăzute în TAGLN2 - / - macrofage (figura 4b). Similar cu zonele de formare a paharului fagocitar (Fig.3e), TAGLN2 a fost, de asemenea, complet co-localizat cu F-actin (LifeAct) în zonele cu membrane de ruffling și lamellipodia site-uri de amplificare a polimerizării actinice depolimerizată - în celulele RAW264.7 cu PMA (Video suplimentar 8).

TAGLN2 mediază perturbarea membranei în macrofagele stimulate cu LPS. ( a ) Formarea de rupere a membranei în macrofage peritoneale stimulate de fMLP (200 nM) de la șoareci de tip sălbatic și TAGLN2 - / - . LPS-stimulate și macrofagele peritoneale cu deficiență de ser au fost tratate cu fMLP timp de 2 minute, fixate și colorate pentru F-actină cu faloidină TRITC. Scară de bare, 5 μm. Cuantificarea colilor de membrană indusă de fMLP în macrofagele de tip sălbatic și TAGLN2 - / - prin indicele de rupere. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SEM ale indicelui de rupere a patru câmpuri aleatorii. * P 0, 05 față de macrofagele de tip sălbatic tratate cu LPS. Acest rezultat este reprezentat de trei experimente independente. ( b ) Lipsa activității protruzive a membranei în TAGLN2 - / - macrofage. Tabele reprezentative din videoclipuri și kimografe obținute după stimularea fMLP. Macrofagele peritoneale de la șoareci de tip sălbatic și TAGLN2 - / - au fost fără foame timp de 3 ore înainte de stimularea fMLP. Imaginile DIC au fost colectate la intervale de 10 secunde timp de 10 minute (vezi Videoclipuri suplimentare S6-S7). Au fost generate mai multe kimografe ( n = 4-6) din fiecare celulă folosind software-ul EMBL ImageJ. Analiza cantitativă a activității de proeminență (viteză, distanță și timp) a inclus un total de trei regiuni diferite pe tratament din fiecare experiment ( n = 3 experimente independente). Scară de bare, 5 μm. ( c ) imagini SEM de rufling în macrofage TAGLN2 - / - de tip sălbatic. Scară de bare, 5 μm.

Imagine de dimensiune completă

TAGLN2 îmbunătățește fagocitoza prin căile de semnalizare PI3K / AKT și ERK

Este bine stabilit faptul că polimerizarea F-actinei la locurile inițiale de fagocitoză depinde de cascadele de semnalizare PI3 kinază (PI3K) / AKT5. În plus, calea de transducție a semnalului Ras-MAPK și căile legate de ERK, care sunt implicate în transducția semnalului de la tirozin kinazele receptorului, receptorii factorului de creștere, anumiți receptori cuplați în proteina G și TLR, sunt, de asemenea, cunoscuți pentru a promova proliferarea, diferențierea și în special activarea și polarizarea macrofagelor 26 . Prin urmare, am testat dacă TAGLN2 este conectat cu căi de semnalizare PI3K / AKT și MAPK în macrofage. Mai întâi am investigat aceste evenimente de semnalizare în macrofagele de repaus ca răspuns la semnalarea mediată de LPS-a TLR4. Interesant, deficitul TAGLN a avut un efect redus asupra activării AKT și MAPK mediate de LPS, inclusiv ERK și JNK (Fig.5a), sugerând că TAGLN2 nu este direct implicat în activarea mediată de TLR4 a căilor de semnalizare Ras-ERK sau PI3K. Ca oa doua evaluare, am măsurat evenimentele de semnalizare induse de fMLP în macrofagele de repaus sau LPS-activat (timp de 24 de ore). În mod surprinzător, activările mediate de fMLP ale PI3K / AKT precum și ERK nu au fost diferite în starea de repaus a ambilor macrofage (Figura 5b). Cu toate acestea, aceste evenimente au fost semnificativ reglate în cazul macrofagelor TAGLN2-knockout activate de LPS (Figura 5b). Aceste rezultate sugerează că TAGLN2 este asociat cu polimerizarea și rearanjarea actinei în timpul fagocitozei bacteriene.

TAGLN2 este necesară pentru activarea căilor de semnalizare PI3 kinază / AKT și Ras-ERK. ( a ) Macrofagele peritoneale de la șoareci de tip sălbatic și TAGLN2 - / - au fost stimulate cu LPS (1 pg / ml) pentru punctele de timp indicate. Formele fosforilate și totale ale AKT, ERK și JNK au fost detectate prin Western blot. ( b ) Macrofagele peritoneale au fost preactivate cu LPS (1 pg / ml) timp de 24 de ore. Celulele au fost înfundate în ser timp de 3 ore și au fost stimulate cu fMLP (1 pM) pentru perioadele indicate. Lizatele de celule au fost supuse unui blot western cu anti-fosfo și total PI3K, AKT, ERK și JNK. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente. Lentile / gelurile cu lungime întreagă sunt prezentate în figura suplimentară S9.

Imagine de dimensiune completă

TAGLN2 - / - șoarecii prezintă o sensibilitate crescută la peritonita bacteriană

În cele din urmă, am stabilit dacă reglementarea fagocitoză de către TAGLN2 afectează răspunsul gazdei la infecția bacteriană. Inocularea intraperitoneală a Escherichia coli care exprimă GFP a dus la o mortalitate de ~ 50% după 48 ore la șoareci de tip sălbatic (Fig.6a). Curbele de supraviețuire Kaplan-Meier pentru șoarecii de tip sălbatic și TAGLN2 - / - injectați cu E. coli și Salmonella au arătat că șoarecii TAGLN2 - / - prezintă semnificativ ( p = 0, 028, respectiv 0, 018) mortalitate crescută comparativ cu tipul lor sălbatic omologii în fiecare zi după injectare. Pentru infecția cu Salmonella s-au obținut rezultate similare (Figura 6a). La 4 ore postinfecție cu 10 8 CFU de E. coli, șoarecii TAGLN2 - / - au prezentat mai mult (~ 2 ori) bacterii în lichidul de lavaj peritoneal decât șoarecii WT ( Fig.6b ), indicând clearance-ul bacterian defect în TAGLN2 - / - șoareci. Sepsisul este caracterizat prin clearance-ul bacterian ineficient și supraexprimarea citokinelor inflamatorii 1 . Prin urmare, am examinat efectele nocturnei TAGLN2 asupra producției de citokine în timpul sepsisului indus de Salmonella . În mod deosebit, la 1-2 ore după infecție, șoarecii TAGLN2 - / - au prezentat niveluri plasmatice mai mari de TNF-a, IL-6, IL-1 β și IL-12 decât șoareci de tip sălbatic (Figura 6c). În cele din urmă, deoarece șoarecii TAGLN2 - / - utilizați în acest studiu au fost șoareci knock-out întregi, a fost imposibil să se facă diferența între efectele primare și secundare ale deficienței TAGLN2 în alte țesuturi sau celule. Prin urmare, am efectuat transferul adoptiv al macrofagelor peritoneale după epuizarea farmacologică a macrofagelor într-un model de șoarece de septicemie bacteriană. Șoarecii cu TAGLN2 - / - macrofage transferate adoptiv au prezentat o mortalitate mai mare ca răspuns la DH5α și Salmonella decât la macrofagele de tip sălbatic (Fig.6d). Aceste rezultate au demonstrat că TAGLN2 este un factor corespunzător pentru funcția fagocitară mediată de macrofage împotriva infecției bacteriene, ameliorând astfel sepsisul bacterian.

TAGLN2 participă la supraviețuirea gazdei după peritonită bacteriană. ( a ) șoarecii TAGLN2 - / - demonstrează o supraviețuire redusă după septicemia peritoneală bacteriană. Șoarecii de tip sălbatic de tip sălbatic (linia neagră) și TAGLN2 - / - (linia roșie) au fost injectați ip cu 5x108 CFU de E. coli viu (DH5a) sau 5 x 106 CFU de S. typhimurium viu. Se indică curbele de supraviețuire Kaplan-Meier care arată proporția șoarecilor care sunt în viață în fiecare grup, în funcție de timpul de la prima injecție de bacterii. ( b ) Numărul de celule E. coli în lichidul de lavaj peritoneal de la șoareci de tip sălbatic sau de la șoareci TAGLN2 - / 4 h după administrarea ip de 10 8 CFU / șoarece de E. coli este prezentat ca graf de bare ( n = 6). * P 0, 05 față de macrofagele de tip sălbatic tratate cu LPS. ( c ) Nivele de citokine (TNF-a, IL-1p, IL-6 și IL-12) în plasmă la 0, 1 și 2 ore după injectarea ip de 5 x 106 CFU de S. typhimurium viu în mediu sălbatic, tip și TAGLN2 - / - șoareci. Datele sunt media ± SEM; n = 8 pe grup. * i 0, 05 vs. soareci de tip sălbatic în același punct de timp. ( d ) Loturile citometrice de flux ale macrofagelor CD11b +, F4 / 80 + izolate din splină în ziua 2 după tratamentul cu lipozomi de clodronat pentru epuizare (n = 3 per grup). Supraviețuirea după transferul macrofagilor peritoneali de tip sălbatic și TAGLN2 - / - peritoneal la șoareci de tip sălbatic primitori cu sepsis indus de E. coli sau S. typhimurium ( n = 15 / grup).

Imagine de dimensiune completă

Disscusion

Pentru a înfrânge în mod eficient agenții patogeni, macrofagele prezintă activitate fagocitară avansată 27, 28 . Cu toate acestea, factorii de proeminență sau de rupere a membranei, care sunt în mod complex legați de funcțiile fagocitare și care apar după contactul cu agenți patogeni bacterieni, nu sunt pe deplin înțeleși. Inițial, TAGLN1 a fost identificat ca proteină actin-gelifiant sau actin-reticulat și a fost acceptat ca marker al diferențierii mușchiului neted 10, 11 . TAGLN3 (= NP25) a fost descoperit mai târziu și este cunoscut că funcționează în creșterea neuritului 15 . Cu toate acestea, funcția TAGLN2 a fost relativ necunoscută. În acest raport, am arătat că inducerea TAGLN2 de către LPS joacă un rol esențial în funcția fagocitară a macrofagelor. Acest lucru este demonstrat în mod concludent prin funcțiile fagocitare reduse ale sRBC și E. coli acoperite cu IgG sau IgM de către macrofagele cu deficit de TAGLN2 stimulate cu LPS. Actriminarea și activarea PI3K / AKT și ERK au fost, de asemenea, afectate semnificativ în macrofagele deficiente de TAGLN2. In mod special, soarecii cu TAGLN2 - / - macrofage au aratat o mortalitate mai mare dupa peritonita bacteriana. Astfel, concluziile noastre sugerează că TAGLN2 este un factor esențial al macrofagelor pentru apărarea gazdei, menținând imunitatea protectoare în septicemia bacteriană.

Faptul că TAGLN2 este supra-indus ca răspuns la LPS atât la nivelul macrofagilor peritoneali cât și al măduvei osoase sugerează cu siguranță că acesta joacă un rol în macrofage în raport cu infecția. Cu toate acestea, macrofagele de repaus au mecanisme preexistente pentru internalizarea și curățarea materialelor microbiene prin intermediul fagocitozei mediate de receptor. Astfel, se pune întrebarea de ce macrofagele au nevoie de o moleculă suplimentară ca TAGLN2 pentru a înghiți agenții patogeni? În anumite condiții, fagocitoza mediată de receptor în sine nu poate fi suficientă pentru eliminarea eficientă a agenților patogeni microbieni. De exemplu, unele bacterii pot modula capacitatea de ucidere a macrofagelor prin tulburarea funcției fagocitare mediate de receptor 29 . Astfel, ca o alternativă la fagocitoza mediată de receptor, macrofagele pot, de asemenea, să internalizeze materialele prin macropinocitoză, ceea ce permite internalizarea unor cantități mari de materiale fără nici un angajament al receptorilor 30 . Într-adevăr, am constatat că TAGLN2 - / - macrofagele de repaus au avut o capacitate redusă de a absorbi dextranul (TxR-dextran), indicând macropinocitoza afectată. Cu toate acestea, macropinocitoza este cunoscută a fi stabilită în jos în macrofage sau în celulele dendritice tratate cu LPS, probabil pentru a maximiza prezentarea antigenilor capturați 31 . De asemenea, am observat că tratamentul cu LPS a redus semnificativ macropinocitoza atât în ​​macrofagele de tip sălbatic, cât și în cele cu deficit de TAGLN2. Prin urmare, este puțin probabil ca expresia TAGLN2 să fie direct legată de macropinocitoză. Cu toate acestea, capacitatea redusă pentru macropinocitoză în macrofagele cu deficit de TAGLN2 a indicat faptul că TAGLN2 a fost, de asemenea, implicat în macropinocitoză. Astfel, este posibil ca prezența TAGLN2 să permită extinderea suprafeței membranei, ceea ce stabilește un contact eficient al particulelor și permite legarea unui număr mai mare de bacterii pe celulă.

A fost interesant de observat că, printre trei membri ai familiei TAGLN, TAGLN2 a fost singura izoformă care poate fi indusă prin stimularea LPS. Inhibarea expresiei TAGLN2 de către inhibitorii NF-kB a sugerat un rol major pentru NF-kB în inducerea TAGLN2 în macrofage. În concordanță cu aceasta, regiunea promotor 5 (-150 la -200 bp) din TAGLN2 conține secvența de legare pentru NF-kB, în timp ce ceilalți membri ai familiei TAGLN nu au această secvență. Interesant, am constatat că TAGLN2 este indus de TNF-a, care este un semnal de declanșare pentru activarea macrofagelor, sugerând astfel că inducerea TAGLN2 este controlată de semnalele secundare de declanșare în loc de semnale de primare cum ar fi IFN-y32.

Semnalarea în amonte de TAGLN2 nu a fost investigată în prezentul studiu. Un raport anterior a demonstrat că proteina kinaza C (PKC) acționează în amonte de TAGLN1 în celulele musculare netede vasculare 33 . Mai mult, PFTK, o proteină kinază serină / treonină asociată cu cdc2, controlează fosforilarea TAGLN2 la S83 și S163 în carcinomul hepatocelular 34 . Ambele rapoarte au demonstrat că fosforilarea induce disocierea TAGLN de citoscheletul actinic in vivo 33, 34, care este în concordanță cu rezultatele unui studiu in vitro în care substituția S181D, care imită forma fosforilată, a redus legarea TAGLN1 la actin 13 . Cu toate acestea, va fi necesară o abordare mai elaborată pentru a descoperi relevanța fosforilării TAGLN2 in vivo . De exemplu, Lv și colab . a demonstrat că fosforilarea TAGLN1 induce depolimerizarea actinei, în timp ce Leung și colab . a sugerat că TAGLN2 defosforilat este o formă activă care mediază depolimerizarea 34, 35 . În afară de semnalarea în amonte, totuși, am constatat că TAGLN2 influențează dinamica actinei mediată de fMLP prin activarea semnalizării PI3K / AKT și a Ras-ERK în macrofagele activate LPS5. Aceste rezultate au sugerat că TAGLN2 a jucat un rol esențial în fagocitoza în macrofagele activate, în principal prin rearanjarea actinei la locul contactului bacterian.

Desi intelegem ca TAGLN2 este o proteina legata de actina care functioneaza sa lega si sa stabilizeze filamentele actinice si contracareaza si actiunea cofilinei 21, intrebarea principala este cum aceasta proteina in cele din urma poate controla ruperea membranelor macrofagelor activate. Interesant, am constatat recent că TAGLN2 poate polimeriza G-actina în condiții de sare scăzută unde polimerizarea cu actină este, în mod normal, complet suprimată (rezultat nepublicat). De fapt, după cunoștințele noastre, doar câteva proteine ​​pot induce polimerizarea actinei în condiții de sare scăzută. Fragmentele de proteine ​​ale mușchilor scheletici, nebulină și miozină S-1, precum și regiunea cozii de vinculin sunt cunoscute că leagă actina și induc polimerizarea în condiții de sare scăzută 36, 37, 38 . Atât fesselinul (mușchiul neted aviar) cât și caldesmonul se leagă de G-actin și determină transformarea sa în F-actină într-o varietate de condiții, inclusiv absența virtuală a sării 39, 40 . Cu toate acestea, nu există indicii că aceste fragmente participă direct la ruperea membranei în celule. Interesant, totuși, sa demonstrat că LL-37, o peptidă antimicrobiană secretă din macrofage, leucocite polimorfonucleare și keratinocite, induce polimerizarea G-actinei - probabil prin interacțiuni electrostatice nespecifice între LL-37 și actin în condiții de sare scăzută 41 - și crește fagocitoza macrofagelor 42 . În plus, distrugerea unui analog LL-37 la șoareci ( Cnlp - / -) diminuează fagocitoza bacteriană 42 . Prin urmare, pentru a înțelege mecanismul activității fagocitare crescute mediate de LL-37, ar fi util să investigăm dacă LL-37 controlează rufarea membranelor macrofage în timpul fagocitozelor. În plus față de LL-37, rapoartele anterioare au demonstrat că proteina de proteină de invazie Salmonella A (SipA), care este una din componentele sistemului de secreție proteică de tip III (TTSS) codificată bacterial ( 43, 44) in vitro și declanșează proeminențe de mari dimensiuni ale membranei și maneci în locul introducerii Salmonella 43, 45 . Dacă acest lucru este adevărat, este izbitoare, deoarece acest lucru sugerează că, deși ambii agenți patogeni invazivi și macrofagii gazdă au scopuri complet opuse pentru fagocitoză, ei folosesc un mecanism foarte similar pentru a-și atinge obiectivele.

Infecția bacteriană este o cauză principală de septicemie care ridică o morbiditate și o mortalitate ridicată 1 . Fagocitoza bacteriilor este una dintre cele mai importante răspunsuri imune inițiale care pot bloca diseminarea timpurie a bacteriilor infectate 2 . În acest sens, dezvoltarea peptidelor permeabile la celulă care prezintă funcții TAGLN2 poate avea o valoare clinică potențială pentru tratamentul sepsisului bacterian. Efectele peptidelor TAGLN2 permeabile la celule în ambele macrofage și celulele T sunt în prezent în curs de investigare.

În concluzie, am constatat că TAGLN2 este singurul membru al familiei TAGLN, care poate fi indus în exces ca răspuns la LPS în macrofage. După inducție, TAGLN2 a recrutat la membrană și a făcut rearanjamente citoscheletale la scară largă care sunt necesare pentru proeminența membranei și pentru rufare și, eventual, pentru funcția fagocitară. Aceste rezultate sugerează că TAGLN2 este un factor endogen important care protejează gazda de septicemie legată de infecții bacteriene prin controlul dinamicii actinelor la manecile de membrană. Acest studiu nu numai că a dezvăluit un rol neașteptat pentru TAGLN2, dar a oferit, de asemenea, o perspectivă importantă asupra armamentului molecular complex, necesar pentru apărarea normală a gazdei.

Materiale si metodeMouse-uri

Șoareci de tip sălbatic C57BL / 6 au fost achiziționați de la Damul Science (Coreea) și toți șoarecii au fost adăpostiți în condiții de patogeni specifici. TAGLN2 ( TAGLN2 - / - ) șoareci knock-out au fost descriși anterior 21 . Toate metodele și protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale al Școlii de Științe ale Vieții, Institutul de Știință și Tehnologie din Gwangju și au fost realizate în conformitate cu liniile lor aprobate (IACUC GIST-2015-04).

celulele

Celulele T de tip Jurkat (TIB-152), celulele A7r5 (CRL-1444) și celulele RAW 264.7 (TIB71 ™) au fost menținute în RPMI-1640 sau DMEM (Invitrogen) suplimentat cu FBS 10% . Celulele T CD3 + de la șoarece au fost purificate din splină și ganglioni limfatici pe o coloană de îmbogățire a celulelor T (R D Systems). Splenocitele de spital au fost dispersate și purificate în CD4 +, CD8 + și CD19 + populații prin separarea celulară MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania). Puritatea fiecărei populații a fost confirmată ca 95% prin citometrie în flux. Lizatul creierului mouse-ului a fost obținut de la șoareci de tip sălbatic C57BL / 6. Izolațiile macrofage peritoneale s-au efectuat 60 de ore după o injecție intraperitoneală de 2, 5 ml soluție 3% de tioglicolat (Sigma) prin lavaj peritoneal cu 5 ml de PBS. Celulele retrase au fost cultivate timp de 1 oră la 37 ° C și apoi clătite pentru a îndepărta celulele suspendate. Dintre aceste celule aderente, 99% au fost macrofage F4 / 80 + . Pentru a prepara medii condiționate pentru diferențierea BMDM, celulele L929 au fost cultivate în DMEM cu 10% FBS și 1% penicilină / streptomicină la 37 ° C într-un incubator 5% C02. Mediile de cultură de celule au fost colectate și filtrate utilizând filtre de 0, 22 pm și ținute la -20 ° C. Celulele măduvei osoase din măști au fost izolate din femur și tibie și cultivate în RPMI-1640 suplimentat cu 30% mediu mediu condiționat L929. După 6 zile, BMDM s-au confirmat a fi 90% prin citometrie cu flux cu CD11b + și F4 / 80 + .

constructe cADN

Promotorul pEGFP-N1 (promotorul CMV, vectorul Clontech, Mountain View, CA) care codifică TAGLN2 (TG2) și LifeA_RFP a fost descris în lucrarea noastră anterioară 21 . Siturile de legare a factorilor de transcripție din TAGLN1, 2 și 3 au fost identificate utilizând programul de calculator Factor (pachetul de programe HUSAR, DKFZ Heidelberg). Pentru testul promotor, promotorul uman TAGLN2 (1 kb în amonte) a fost donat prin PCR folosind ADN genomic T3 al celulei CD3 ca șablon. Mutanții regiunii promotor TAGLN2 care au fost indicați în fig.1f au fost generați și verificați prin secvențiere (Macrogen, Seoul, Coreea). Toate produsele PCR obținute au fost donate în fața vectorului vecter luciferază pGL-2 (Promega, Heidelberg, Germania).

Microscopie prin scanare electronica

Pentru microscopia electronică de scanare (SEM), macrofagele peritoneale provocate de tioglicolat, crescute pe placheta Si, au fost lipsite de ser timp de 3 ore. Unde s-a indicat, celulele au fost prestimulate cu 1 pg / ml de LPS. Celulele au fost apoi incubate cu E. coli timp de 10 minute sau stimulate cu fMLP timp de 2 minute. După incubare, celulele au fost clătite cu PBS și prelucrate pentru SEM.

Microscopie confocală

Pentru imagistica localizării TAGLN2 endogene, macrofagele peritoneale au fost permeabilizate cu PBS-T timp de 10 min, blocate cu 1% BSA / PBS timp de 1 h, clătite cu PBS și incubate cu anticorp anti-TAGLN2 peste noapte la 4 ° C. Anumiți anticorpi au fost adăugați după spălare și incubați la întuneric timp de 1 oră la temperatura camerei. Pentru a vizualiza fagocitoza E. coli in vitro , E. coli care exprimă GFP a fost generată prin transformarea cu pGEX4T_GFP. Images were recorded every 10 s for a total of 900 s using an FV1000 laser scanning confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan). For live imaging in RAW 264.7 cells, 2 × 10 6 polystyrene beads of diameter 4.5 μm (Polysciences Inc., Warrington, PA) were incubated in 10 mg/mL bovine serum albumin (BSA, Sigma) in PBS for 1 h at 4 °C. The beads were then washed 5 times in PBS and resuspended in 1 mL PBS. Rabbit anti-bovine albumin, IgG fraction (anti-BSA IgG, BD bioscience), was added at a final dilution of 1:500 and incubated for 30 min at 37 °C and 10 min at 4 °C. The beads were then washed thrice in 1 mL PBS.

Reverse transcription quantitative (RT-q) PCR

Total RNA was isolated from cells or homogenized tissues of C57BL/6 mice with TRI Reagent (Molecular Research Center, Inc.) and reverse-transcribed using RT-Premix (iNtRON biotechnology). Primer sequence and PCR condition were described in Supplemental methods.

Luciferase assay for NF-κB activity

Freshly isolated peritoneal macrophages were plated in 12 well plates the day before transfection and transfected with 1 µg of full-length of TAGLN2 reporter construct or 5′ deletion mutants with 1 µg of pRL-TK renilla and 1 µg of pGL3/NF-κB. At 48 h post-transfection, cell lysates were prepared and assayed for luciferase activity using the Dual Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI), according to the manufacturer s instructions.

Ruffling assay

Cells were starved for 3 h and fMLP (200 nM) was added to the media. After 2 min, the cells were fixed, permeabilized, and stained with TRITC-phalloidin. Ruffling index was recored as described previously 46 . For time-lapse imaging of membrane dynamics, cells were grown on glass bottom tissue cultured plate and serum-starved for 3 h before stimulation with fMLP. Differential interference contrasts (DICs) were acquired without or with fMLP over 10 min with 10-s intervals using a confocal microscope (see Supplemental methods).

Determination of cellular F-actin content

Macrophages were treated with LPS for 24 h and then the cells were fixed with 4% paraformaldehyde. Fixed cells were washed once with PBS and resuspended in PBS containing 1% BSA and 0.25% Triton X-100 for 5 min. After permeabilization, cells were washed, stained for 30 min with TRITC-phalloidin, and then analyzed by FV1000 confocal microscope (Olympus) or FACScanto flow cytometry (BD). In some experiments, LPS-stimulated macrophages (24 h) were further stimulated with 200 nM fMLP.

In vitro and vivo phagocytosis assay

In vitro Fc- or CR-mediated phagocytosis was performed as previously described 47 and detailed in Supplemental methods. To measure in vivo phagocytic activity, GFP-expressing E. coli (10 8 CFU/mouse, DH5α) were injected into either wild-type or TAGLN2 −/− mice ip, and macrophages were harvested 2 h later.

Sepsis and bacterial burden determination

For sepsis models with a single bacterial species, bacterial peritonitis was induced by ip injection of either 5 × 10 8 CFU of live E. coli (DH5α) or 5 × 10 6 CFU of live S. typhimurium . Survival was monitored once per 12-h period for 72 h. For determination of bacterial burden, thioglycollate-induced peritoneal macrophages (10 7 ) obtained from wild-type or TAGLN2 −/− mice were suspended in 200 μL PBS and injected ip into wild-type recipient mice with 1 × 10 8 CFU of live E. coli (DH5α) bacteria. At 4 h post-injection, 5 mL of PBS was injected into the peritoneal cavity and peritoneal lavage fluid were diluted in sterile PBS, plated onto separate Luria-Bertani agar plates, and the plates were incubated for 24 h at 37 °C. Colonies were counted separately for each sample.

Measurement of cytokines

Cytokines were measured from plasma using ELISA kits from R D Systems, as per the manufacturer s protocol. The levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, and IL-12 were measured at the indicated times after injection of S. typhimurium .

In vivo macrophage depletion and adoptive transfer

Macrophages were depleted using clodronate liposomes. Mice were injected ip with 200 μL of a suspension of clodronate liposomes or control liposomes 48 h before being infected with E. coli or S. Typhimurium . The depletion analysis was performed at 48 h after treatment by flow cytometry using F4/80 and CD11b staining. Clodronate liposome treatment resulted in an 85% decrease of macrophages in the spleen. Thioglycollate-induced peritoneal macrophages (10 7 ) obtained from wild-type or TAGLN2 −/− mice were suspended in 200 μL PBS and injected ip into clodronate liposome-treated recipient mice.

Statistici

Mean values were calculated from at least three independent experiments unpaired Student s t-tests, and one-way analysis of variance (ANOVA) tests were used to identify significant differences between multiple groups. A P- value 0.05 was considered significant. Kaplan-Meier survival curves were calculated using the Prism software.

Recunoasteri

This work was supported by the Basic Science Program (2015R1A2A1A15052658) and the Creative Research Initiative Program (2015R1A3A2066253) through National Research Foundation (NRF) grants funded by the Ministry of Science, ICT Future Planning (MSIP), and Basic Science Program (2013R1A6A3A04064259) through National Research Foundation (NRF) grants funded by the Ministry of Education (MOE), Korea, and the GIST Research Institute (GRI) in 2017.

Material suplimentar electronic

Informatie suplimentaraVideoclip suplimentar 1Videoclip suplimentar 2Videoclip suplimentar 3Video suplimentar 4Video suplimentar 5Video suplimentar 6Supplementary Video 7Supplementary Video 8Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva abuziv sau care nu respectă termenii sau indicațiile noastre, vă rugăm să îl marcați ca neadecvat.

Alegerea Editorului

>>> 更多资讯详情请访问蚂蚁淘商城