本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测菜豆普通花叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及应用。

背景技术：

菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus，BCMV)是仅次于大豆花叶病毒病的一种豆科植物病毒病，在国内分布也较为普遍，田间感病率较高，侵染范围较广，可以侵染多种菜豆属的植物，如大豆、蚕豆、小豆、绿豆、洋刀豆、决明、鹰嘴豆、豌豆等豆类。BCMV传播途径比较多，常见的有蚜传、种传和花粉传毒，也可通过机械摩擦接种到不同属的植物上。蚜虫获毒期一般仅为15-60s，获毒后，lmin内即可传毒，因而通过蚜虫传毒效率很高。由于BCMV寄主范围大，传播方式多，所以该病毒在国内外引起极大的重视。

目前，检测菜豆普通花叶病毒的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光PCR法。指示植物检测法比较简单，但其检测速度很慢，而且无法确定侵染病毒的种类，灵敏度也较低。国内外已有很多利用ELISA方法检测菜豆普通花叶病毒的报道，该方法灵敏度高，操作简单，但所需检测时间也在1～2天，而且抗体制备周期长，费用较高，灵敏度不及RT-PCR。利用分子生物学技术建立的RT-PCR、免疫捕捉RT-PCR、实时荧光RT-PCR及探针杂交检测等方法，使得菜豆普通花叶病毒的检测结果更为快速、灵敏、准确。但传统基于PCR的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。因此许多不依赖PCR仪的等温扩增技术被发明出来，尤其以LAMP应用最为广泛。

RPA(Recombinasepolymeraseamplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮组下使模板DNA解链，引物于模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中未存在RPA法检测菜豆普通花叶病毒的问题，本发明的目的之一是提供了基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物、探针、试剂盒，本发明的另一目的是提供上述引物、探针、试剂盒的应用，本发明的目的之三是提供一种检测菜豆普通花叶病毒的方法。

技术方案：本发明所述的基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物和探针组合，其特征在于，包括：

上游引物：5′-TTAGATCATCTGTTGGATTACAAGCCAGAACA-3′；

下游引物：[5’BIOTIN]CACCACACCATAAAGCCATTCATCACAATTGA-3′；

探针：[5’FAM]ACAAAGATGCAGTTTGAAATGTGGTACAAT[THF]CTGTGAAGGAAGAGTA[3’BLOCK]。

本发明还提供了一种基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的试剂盒，包含所述的引物和探针组合。

所述的试剂盒还包括测流层析试纸条、测流层析试纸条缓冲溶液、RPA酶、RPA缓冲液、醋酸镁溶液、ddH2O、对照品中的一种或几种。这些成分可以自行配制，也可以采用市售产品，如一种比较好的选择，测流层析试纸条、测流层析试纸条缓冲溶液采用德国Milenia Biotec GmbH公司的Milenia GenLine HybriDetect试剂盒；RPA酶、RPA缓冲液、醋酸镁溶液采用TwistDX公司的TwistAmpTMnfo kit。

本发明还提供了所述的基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物和探针组合在检测菜豆普通花叶病毒中的应用。

本发明还提供了所述的基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的试剂盒在检测菜豆普通花叶病毒中的应用。

本发明最后提供了一种检测菜豆普通花叶病毒的方法，包括：以待测样品的cDNA作为模板，利用所述的引物和探针组合进行RPA扩增，鉴定扩增产物。

其中，采用侧流层析试纸条上对扩增产物进行鉴定，根据试纸条上显示结果判定菜豆普通花叶病毒为阳性或阴性。具体方法为：取2μL扩增产物与98μL HybriDetect Assay Buffer溶液混匀形成混合液，然后吸取10μL混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μL HybriDetect Assay Buffer溶液(测流层析试纸条缓冲溶液)的离心管中，5分钟后观察试纸条上显示结果。

RPA扩增的总反应体系为50μL，浓度10μM的上游引物2.1μL，浓度10μM的下游引物2.1μL，浓度10μM的探针0.6μL，Buffer 29.5μL，ddH2O 12.2μL、1μL待测样本的cDNA模板、2.5μL浓度为280mM的MgAc、RPA酶源自TwistDX公司的TwistAmpTMnfo kit。

扩增条件为：39℃，20分钟。

有益效果：

本发明针对菜豆普通花叶病毒CP基因，设计了基于RPA技术的引物和探针，由于目前对于RPA技术的引物和探针并没有形成设计规则，且常规PCR设计的引物、探针并不适用RPA反应，因此需要技术人员不断尝试和探索，发明人经过了大量的实验和摸索，获得了一组特异性高、灵敏度好的引物和探针组合。

本发明是建立在分子生物学基础上的，先基于菜豆普通花叶病毒CP基因设计了特定引物和探针，该基因不仅高度保守，而且对其它病原高度特异，再应用重组酶聚合酶扩增-测流层析的方法制备了快速检测菜豆普通花叶病毒的试剂盒，敏感性高，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需30分钟，结果的判定只需观察测流层析试纸条显示的结果即可，操作极其简便；得到核酸样品后整个反应过程可以在非实验室环境下进行，不仅适用于室内鉴定而且可以应用于田间现场检测。

附图说明

图1为实施例1RPA检测方法的建立的结果，图中，左：菜豆普通花叶病毒；右：阳性对照；

图2为RPA灵敏度实验检测结果，图中由左至右模板cDNA的稀释度分别为1、10-1、10-2和10-3；

图3为特异性实验结果图，图中由左至右依次分别为：菜豆普通花叶病毒、大豆花叶病毒、芜菁花叶病毒、阴性对照、阳性对照；

图4为对比例1的检测结果，图中，由左至右依次分别为：菜豆普通花叶病毒、大豆花叶病毒、芜菁花叶病毒、阳性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的RPA扩增试剂盒TwistAmpTMnfokits是TwistDX公司的产品，产品目录号为TANFO02KIT。

下述实施例中的大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)在文献\"崔晓艳，陈新，栾鹤翔，智海剑.2013.大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库的构建.植物病理学报.43(5):556-560.”中公开过，公众可从江苏省农业科学院获得。也可以采用其他公开的大豆花叶病毒株系。

下述实施例中的菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus)在文献\"沈良,崔瑾,夏妍,崔晓艳,陈新.2014.一种新发现的侵染绿豆的菜豆普通花叶病毒分子鉴定.华北农学报.29(4):1-8.”中公开过，公众可从江苏省农业科学院获得。也可以采用其他公开的菜豆普通花叶病毒株系。

下述实施例中的芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus)在文献\"Xiaoyan Cui,HodaYaghmaiean,Guanwei Wu,Xiaoyun Wu,Xin Chen,Greg Thornc and Aiming Wang.2017.The C-terminal region of the Turnip mosaic virus P3protein is essential for viral infection via targeting P3to the viral replication complex.Virology.510:147-155.”中公开过，公众可从江苏省农业科学院获得。也可以采用其他公开的芜菁花叶病毒株系。

实施例1

用于检测菜豆普通花叶病毒的RPA引物、探针及其RPA试剂盒包括：

一、RPA引物、探针的设计与合成

参考GenBank中菜豆普通花叶病毒的CP基因(本实施例株系测得的序列，网上比对，同源率最高96％的genbank登录号为KP903372)的保守序列，选择特异性保守区域(KP903372中位置为9186-9343)，设计RPA引物和探针。所有引物和探针均由上海英俊生物技术有限公司合成，引物和探针的碱基序列如下所示。

上游引物(SEQ ID NO.1)：

5′-TTAGATCATCTGTTGGATTACAAGCCAGAACA-3′；

下游引物(SEQ ID NO.2)：

[5’BIOTIN]CACCACACCATAAAGCCATTCATCACAATTGA-3′；

探针(SEQ ID NO.3)：

[5’FAM]ACAAAGATGCAGTTTGAAATGTGGTACAAT[THF]CTGTGAAGGAAGAGTA[3’a phosphate]；

探针中，THF为四氢呋喃，FAM为荧光素，phosphate为磷酸基团；BIOTIN为生物素。

二、试剂盒组成：

(1)RPA引物探针混合液：含SEQ ID NO.1所示上游引物、SEQ ID NO.2所示下游引物、SEQ ID NO.3所示探针，各引物、探针的浓度均为10μM；

(2)HybriDetect Assay Buffer溶液(测流层析试纸条配合使用成分，Milenia GenLine HybriDetect试剂盒，德国Milenia Biotec GmbH公司，货号041)；

(3)侧流层析试纸条(Milenia GenLine HybriDetect，德国Milenia Biotec GmbH公司，货号041)

(4)RPA冻干酶(含聚合酶、重组酶和单链结合蛋白三种)和RPA反应预混液，RPA反应预混液为29.5μL Rehydration Buffer和2.5μL 280mM Magnesium Acetate(醋酸镁)混合液(TwistDX公司，TwistAmpTMnfo kit成分)。

上述试剂盒的具体制备方法为：合成所述引物和探针，按照常规方法购买或配制其余各成分。

实施例2

利用上述试剂盒快速检测菜豆普通花叶病毒的方法，具体包括以下步骤：

(1)重组酶聚合酶扩增(RPA)反应：

使用TwistAmpTMnfo kit配制50μL实时RPA反应体系，加入浓度10μM的上游引物2.1μL，浓度10μM的下游引物2.1μL，浓度10μM的探针0.6μL，Rehydration Buffer 29.5μL，蒸馏水12.2μL，混匀后转入含RPA冻干酶的0.2mL反应管中，将1μL cDNA模板、2.5μL浓度为280mM的MgAc加入该反应管中，39℃，扩增20分钟得到扩增产物。

(2)扩增产物的检测：

扩增反应后吸取2μL RPA扩增产物与98μL HybriDetect Assay Buffer溶液混匀后形成混合液，接着吸取10μL混合液滴加到侧流层析试纸条的加样端，最后将试纸条竖着插入的装有200μL HybriDetect Assay Buffer溶液的离心管中，5分钟后观察试纸条显示的结果，如果试纸条显示两条杠，则为菜豆普通花叶病毒阳性，如果为一条杠则为阴性(图1)。

实施例3本发明的试剂盒的敏感性实验

实验过程为：将菜豆普通花叶病毒cDNA进行RPA扩增反应，每个扩增反应中加入稀释度为1，10-1，10-2，10-3的菜豆普通花叶病毒cDNA为模板。反应结束后按照本发明菜豆普通花叶病毒快速检测方法进行侧流层析试纸条检测，检测结果如图2所示，可以看出，该方法可以检测到反应体系中菜豆普通花叶病毒cDNA(57.416ng/ul)稀释100倍，检测敏感性高。

实施例4

本发明的试剂盒的特异性实验：

实验过程为：用大豆花叶病毒的cDNA、芜菁花叶病毒cDNA与菜豆普通花叶病毒cDNA进行特异性实验，实验结果如图3所示，可以看出，只有检测菜豆普通花叶病毒cDNA的试纸条出现了两条杠，检测其他病毒的试纸条均为一条杠，说明本发明试剂盒对菜豆普通花叶病毒cDNA具有很强的特异性。

对比例1

针对KP903372中位置为9492-9634的序列涉及引物和探针，具体碱基序列

如下：

F(SEQ ID NO.4)：5′-GCATACATTGAGATGAGAAATTCTGAGAGGCC-3′；

Probe(SEQ ID NO.6)：

[5’FAM]CTACTTCGGAATTTGAGGGACAAAAATCTA[THF]CTCGCTACGCT TTTGA[3’a phosphate]；

R(SEQ ID NO.5)：

[5’BIOTIN]GCTTCTCTTGCTCGATCCGATGTTTTGGATGT-3′。

参照实施例4的方法进行特异性检测，检测结果如图4，引物和探针的特异性差，BCMV、SMV、TuMV均能检测出条带。

序列表

110 江苏省农业科学院

120 基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物、探针、试剂盒及应用

160 6

170 SIPOSequenceListing 1.0

210 1

211 32

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

400 1

ttagatcatc tgttggatta caagccagaa ca 32

210 2

211 32

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

400 2

caccacacca taaagccatt catcacaatt ga 32

210 3

211 47

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 misc_feature

222 (31)

223 n为四氢呋喃

400 3

acaaagatgc agtttgaaat gtggtacaat nctgtgaagg aagagta 47

210 4

211 32

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

400 4

gcatacattg agatgagaaa ttctgagagg cc 32

210 5

211 32

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

400 5

gcttctcttg ctcgatccga tgttttggat gt 32

210 6

211 47

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 misc_feature

222 (31)

223 n为四氢呋喃

400 6

ctacttcgga atttgaggga caaaaatcta nctcgctacg cttttga 47

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