Rho1D4纯化体系：专为重组膜蛋白提取设计

               膜蛋白的重要性不言而喻，假如细胞膜是守护细胞的城墙，而膜蛋白就是站在城墙上的各司其职的士兵，肩负着把守城门、传递信号、运输物质等重要职责。膜蛋白 一旦\"失守”，就会造成细胞功能紊乱，进而引起组织和器官发生病变，使身体遭受病痛侵扰。这也就是为什么膜蛋白成为大多数重要的药物研究对象和靶点。        在人体蛋白中，有大约30%是膜蛋白，ＦＤＡ批准的新药中，绝大多数都以膜蛋白为靶点，几乎所有的膜蛋白都是研究热点。然而让人吃惊的是，乐观估计，目前已经被透彻研究清楚结构的膜蛋白仅占膜蛋白总量的1%。        究其原因，是因为膜蛋白依附或横跨在细胞膜的磷脂双分子层上，使膜蛋白的表达、纯化、结晶和结构分析都有很大难度。由于非常难以获得高纯度的膜蛋白，进而解析它们的结构和功能，使根据膜蛋白结构设计药物的方法难以施展，而这种方法是目前开发药物最有效的方法之一，因为药物要能有效治疗并且使副作用最小化，作用位点就必须精准。        很多科研人员想深入研究膜蛋白，希望攻克困扰人类的各种疾病，但由于提取高纯度目标膜蛋白并不便捷，从而影响研发进度。目前市面上有一些专用于膜蛋白提取的试剂盒，大多数只能提取某几种类型的膜蛋白， 有些试剂盒只能提取膜总蛋白（包括质膜和细胞器膜蛋白），但费时费力。         目前，有一种最新型有效的膜蛋白提取工具，并具有高纯度、高特异性、高载量温和提取的优点。是基于1980年科学家在牛眼视网膜中发现的一种命名为Rho1D4的氨基酸序列以及其对应的抗体来作为亲和标签纯化膜蛋白取得了非常好的效果，将Rho1D4抗体链接在琼脂糖或磁珠上，用于亲和层析带有Rho1D4标签的膜蛋白，能近乎完美的解决这些研究难题。 

 1）  什么是Rho1D4?

         Rho1D4是指在牛眼视网膜细胞内的牛视紫红质C端的最后九位氨基酸。Rho1D4得名于与该序列特异性结合的单克隆抗体¹。与Rho1D4抗体结合的表位可以作为针对膜蛋白的超高特异性纯化标记。        通过基因修饰可在欲研究的目标（膜）蛋白C端加上Rho1D4标记（如图1）。一旦加载上该序列，即可用装载有Rho1D4抗体的亲和基质去捕获目标蛋白，随后添加Rho1D4肽，通过竞争性结合基质抗体的方式来洗脱目标蛋白。采用这种方法，相比改变pH值等其他洗脱方式，更加地温和。

图1：假设有3个跨膜域的膜蛋白。Rho1D4标签加到膜蛋白C端，它的序列是T-E-T-S-Q-V-A-P-A

2）  Rho1D4的历史

        Rho1D4的表位和抗体配对最早于20世纪80年代被发现，当时科学家将Rho1D4抗体交联包被在琼脂糖凝胶上，用来纯化通过猴肾细胞表达的牛视紫红质。^1,2从那时起，Rho1D4系统开始被广泛的用于小量膜蛋白提取的研究中，包括GPCR（G蛋白偶联受体），ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter），溶质反向转运体和以及一种含四个跨膜域的膜蛋白。

3）   Rho1D4系统的优势和用途

高纯度       Rho1D4系统包含：标签、抗体偶联亲和基质（琼脂糖或磁珠等）以及洗脱多肽。Rho1D4系统的最大优势在于抗体与抗原相互作用的高度特异性。表位序列和链长对结合至关重要。例如，将第三位丙氨酸替换成甘氨酸，即移去一个甲基基团，抗体将不再与表位结合。同样，完整的九个氨基酸标签会与Rho1D4抗体结合紧密，去除两个氨基酸则阻断结合。因此，含有与Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特异性结合被最小化，因此回收蛋白的纯度非常高。（见表1） ^3,4,5,6,7,8高回收量        而Rho1D4系统的另一个优势是洗脱目标蛋白的高回收率。包括细菌，酵母和哺乳动物细胞系在内的表达系统已经针对特定的GPCR和其他膜蛋白进行了优化。用Rho1D4系统纯化后的膜蛋白通过凝胶过滤以除去用于洗脱的多肽。使用此纯化系统的科研人员均反馈蛋白回收量均达到毫克级。（见表1）^3,4,5,6,7,8纯化的膜蛋白可用于功能性研究         纯化的蛋白可用于功能性研究，如配体结合的特性，蛋白与蛋白间的相互作用。例如，将标记过的ABCA4固定在载有Rho1D4抗体的基质上来确定它与天然配体（一种视网膜的加成物）的亲和结合特性，加入ATP后即释放²。又例如，CD81蛋白被整体固定在涂有Rho1D4抗体的平板上，它表现出和分离可溶蛋白片段与丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的亲和结合力³。另外，有阴离子转运载体AE1结构域的重组蛋白被标记且用Rho1D4系统纯化后表现出与红细胞来源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。

4）   利用Rho1D4纯化膜蛋白图解简述

 

步骤1：结合：将Rho1D4标记的蛋白与载有Rho1D4抗体的琼脂糖一同孵育使得目标蛋白被固定在吸附材料上。	步骤2：清洗：将杂蛋白和其他裂解液成分洗去，留下与亲和基质结合的目标蛋白。	步骤3：洗脱：过量Rho1D4肽与基质竞争性结合，释放出目标蛋白在洗脱液中收集。

 表1：膜蛋白应用实例 

蛋白	表达系统	纯度	产率（所有回收蛋白）	采取的纯化步骤
hCB2G蛋白偶联受体	大肠杆菌	90%	4.5mg/5L 培养物	Rho1D4 IAC+SEC
hVN1R1G蛋白偶联受体	可诱导的HEK293S细胞系（哺乳动物）	90%	1mg/1g细胞	Rho1D4 IAC+SEC
FPR3G蛋白偶联受体	可诱导的HEK293S细胞系（哺乳动物）	90%	2mg/6g细胞	Rho1D4 IAC+SEC
TAAR5G蛋白偶联受体	可诱导的HEK293S细胞系（哺乳动物）	90%	1mg/9g细胞	Rho1D4 IAC+SEC
OR131-2G蛋白偶联受体	可诱导的HEK293S细胞系（哺乳动物）	90%	2.9mg/10g细胞	Rho1D4 IAC,+centrifugation
hOR17-4G蛋白偶联受体	可诱导的HEK293S细胞系（哺乳动物）	90%	7.5mg/2.5L, 培养物	Rho1D4 IAC+SEC
hOR17-4G蛋白偶联受体	无细胞小麦胚芽提取物	70%*	0.3mg/mL, 反应溶液*	Rho1D4 IAC+SEC
CD81四次跨膜蛋白	可诱导的HEK293S细胞系（哺乳动物）	＞95%	26μg/3×107, 个细胞	Rho1D4 IAC
AE1溶质载体	S.啤酒系BJ5457	93%	2.5mg/18L. 培养物	Rho1D4 IAC

*纯度是从低浓度经一步Rho1D4 IAC在反应溶液中得出的；产率是在洗脱成分浓缩并过SEC柱后计算的。表1：有文献报道的使用Rho1D4系统纯化膜蛋白的纯度和产率。尽管很多用Rho1D4系统纯化的膜蛋白均为G蛋白偶联受体家族，该系统也可以有助于辨别其他如转运体之类的膜蛋白。相关文章在参考文献中。IAC：免疫亲和层析；SEC：排阻层析。           参考文献： 1. Hodges, R.S., et al. 1988. Antigen-antibody interaction. J Biol Chem 263: 11768-11775.2. Oprian, D.D., et al. 1987. Expression of a synthetic bovine rhodopsin gene in monkey kidney cells. Proc Natl Acad Sci USA 84: 8874-8878.3. Takayama, H. et al. 2008. High-level expression, single-step immunoaffinity purification and characterization of human tetraspanin membrane protein CD81. PLoS ONE 3: e2314 (DOI: 10.1371/journal.pone.0002314).4. Zhong, M. and Molday, R.S. 2010. Biding of retinoids to ABCA4, the photoreceptor ABC transporter associated with Stargardt Macular Degeneration. Methods Mol Biol 652: 163-176.5. Leck, K.-J., et al. 2010. Study of bioengineered zebra fish olfactory receptor 131-2: receptor purification and secondary structure analysis. PLoS ONE 5: e15027(DOI:10.1371/journal.pone.0015027).6. Bonar, P. and Casey, J.R. 2010. Purification of functional human Cl-/HCO3- exchanger, AE1, over-expressed in Saccharomyces cerevisiae. Protein Express Purif 74: 106-115.7. Wang, X. et al. 2011. Study of two G-protein coupled receptor variants of human trace amine-associated receptor 5. Sci Rep1: 102 (DOI:10.1038/srep00102).8. Wang, X. and Zhang, S. 2011. Production of a bioengineered G-protein coupled receptor of human formyl peptide receptor 3. PLoS ONE 6: e23076 (DOI: 10.1371/journal.pone.0023076).9. Corin, K. et al. 2011. Structure and function analyses of the purified GPCR human vomeronasal type 1 receptor 1. Sci Rep 1: 172 (DOI: 10.1038/srep00172).10. Kaiser, L., et al. 2008. Efficient cell-free production of olfactory receptors: detergent optimization, structure, and ligand biding analysis. Proc Natl Acad Sci USA 105: 15726-15731.11. Cook, B. L., et al. 2008. Study of a synthetic human olfactory receptor 17-4: expression and purification from an inducible mammalian cell line. PLoS ONE 3: e2920 (DOI: 10.1271/journal.pone.0002920).12. Cook, B. L., et al. 2009. Large-scale production and study of a synthetic G protein-coupled receptor: human olfactory receptor 17-4. Proc Natl Acad Sci USA 106: 11925-11930.13. Zhong, M., et al. 2009. Role of the C terminus of the photoreceptor ABCA4 transporter in protein folding, function, and retinal degenerative diseases. J Biol Chem 284: 3640-3649.14. Locatelli-Hoops, S.C. et.al. 2013. Expression, surface immobilization, and characterization of functional recombinant cannabinoid receptor CB2. Biochim. Biophys. Acta 1834 (10):2045-56.

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