生物可降解纳米颗粒的制备及其在基因转染中的应用

材料

试剂

乙酰化牛血清白蛋白（Ac-BSA;Sigma-Aldrich)

细胞裂解试剂（CCLR;Promega)或TritonX-100(1.0¾m/V)溶液

待转染细胞

氯仿

胎牛血清（FBS)

水（无菌）

异丙醇

萤光素酶底物（如果利用萤光素酶为标记基因）（Promega)

细胞培养基

完全培养基（根据细胞系的不同，用RPMI1640或其他的培养液），含10%(m/V)胎牛血清

RPMI1640或其他的无血清的培养液（根据细胞系的不同而选择）

BCA蛋白质检测试剂（MicroBCAkit,Pierce)

磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.4)

质粒DNA(10mg/ml)

聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA，聚乳酸：聚羟基乙酸=50:50,在六氟异丙醇中特性黏度为I.32dl/g;BirminghamPolymersInc.，Alabama)

聚乙烯醇（PVA）（分子质量30000〜70000;87%〜89%水解度

Tris-EDTA缓冲液（pH8.0,灭菌）

仪器

离心管（50ml)

冻干机

滤膜（〇•22um;Millipore)

玻璃管（5ml)

冰浴

37°C培养箱

Microcentrifuge离心管

24孔板

恒温振荡水浴（37°C)

超声波发生器（XL2015sonicatorultrasonicprocessor;MisonixInc.)

紫外分光光度计

真空干燥箱

方法

包载质粒DNA的纳米颗粒通过乳化溶剂挥发法制得，每次可以制备含30〜90mg聚合物的纳米颗粒。以下介绍含30mg聚合物的方法。

溶液的制备

1.聚合物溶液的制备:搅拌下，在5ml玻璃管中，将30mgPLGA溶解在Iml氯仿中，要3〜4h将聚合物完全溶解。

2.制备质粒DNA溶液：将Img质粒DNA溶液（lOmg/ml)与EOOfXlTris-EDTA缓冲液混合，在不涡旋下加人2mg无核酸酶的乙酰化牛血清白蛋白，轻敲试管使BSA溶解。

大约要3h将BSA完全溶解，也可以将DNA溶液与BSA在冰箱中储存过夜，以使BSA完全溶解。

3.制备2.0%(m/V)的PVA溶液：搅拌下，将0.2gPVA(分子质量30000〜70000)缓慢加入到IOml冷的Tris-EDTA缓冲液中，大约需要30min溶解PVA。

在4°C，lOOOr/min离心IOmin,并用0.22um无菌膜过滤以除去不溶的PVA。加人IOul氯仿使PVA溶液饱和。

DNA的包载

4.将上述DNA溶液加入到两份各100ul的聚合物溶液中，涡旋lmin,形成油包水乳液。

5.在冰水浴中用探针式超声器以55W的输出功率将乳液超声处理2min。

此处理过程可减小乳液液滴的大小。在超声前用异丙醇将超声波探针清洗干净，将探针置于乳液的中间，并防止在超声时探针与管壁接触。

6•将乳液分两份加人到含6mlPVA的50ml离心管中，每次滴加后涡旋lmin，形成油包水-7jC包油（water-in-oil-in-water)的双乳液，同步骤5超声5min。

7•室温下，将得到的乳液在同一个管中缓慢搅拌过夜（约18h)，使氯仿挥发。

8.为确保氯仿挥发完全，将悬浮的纳米颗粒在真空干燥箱中搅拌继续干燥lh。

9.在4°C，110OOOg下超速离心20min收集纳米颗粒，同时收集上清液。

10.将纳米颗粒重悬浮于5mlTris-EDTA缓冲液中。首先用缓冲液反复冲洗纳米颗粒直到其全部悬浮，再同步骤5在冰浴中超声30s。

11.重复步骤9与10以除去游离的DNA和PVA。

12•用步骤9的上清液和步骤11的洗涤液确定未被包封的DNA的量，使用紫外分光光度计测试260nm的吸收。测试中，用制备不含DNA的纳米颗粒的步骤9的上清液和步骤11的洗涤液作为参照。

13•用1〜2ml的无菌水重悬浮纳米颗粒并超声lmin。4°C，lOOOr/min离心纳米颗粒悬浮液IOmin，以除去可能存在的纳米颗粒聚集体。

14.收集悬浮液并存放于称量过的离心管中（如果有必要可以分成几份），在80°C下冷冻45min，冻干2d，得到干燥的固体粉末。在4℃下储存冻干的纳米颗粒。

转染方法

15.在24孔板中以3.5X10⁴个细胞/(孔.ml)的密度接种待转染的细胞，使用完全培养基，平行6孔。以同样的细胞密度，不加纳米颗粒作为对照。

16.细胞在24孔板中培养24h。

17.在无菌环境用〇.5mlRPMI1640重悬包载DNA的4mg纳米颗粒（针对不同细胞，也可使用其他无血清的培养液)。在水浴超声器中超声l〇min。

18.用含有10%FBS的RPMI1640(或其他适合细胞生长的营养液）将纳米颗粒悬液稀释至9ml。

19.吸去细胞培养板中的营养液，并加XlmI上述纳米颗粒悬液。

20•在37°C，5%C02条件下培养细胞24h。

21.吸去纳米颗粒悬液，并加人等量的细胞培养液。随后，每隔一天换一次培养液，不再加人纳米颗粒。

22.在合适时间裂解细胞以测量基因表达的水平。

a.用冷的PBS冲洗细胞两次。

b.在每孔中加入〇•1mlIX细胞裂解液（CCLR)或〇•1%U/V)TritonX-100溶液。

c.37C将24孔板在振荡培养箱中振荡3〇min。

23.检测细胞裂解液中基因表达的水平。如果用董光素酶为标记基因，可以用萤光素酶底物通过化学萤光检测基因表达水平，同时用BCA蛋白质定量试剂测定蛋白质含量，以每毫克细胞蛋白质归一化昔光素酶的表达水平。