| SELEX技术除了可以使用RNA文库以外，还可以使用单链DNA文库进行筛选。单链DNA形成高级结构的丰富性也足够用于对许多靶分子的筛选，而且DNA文库具有更好的稳定性，操作也相对简便。 |
| 3\'引物链亲和素磁珠 |
| 电泳仪PCR仪离心机凝胶成像仪液体闪烁仪长波紫外灯紫外分光光度计核酸定暈仪pH计培养箱振荡器洁净工作台 |
| 一、材料与设备1.5\"\"端标记有生物素的3\"引物。2.链亲和素磁珠（Promega公司）。其他设备与试剂与RNA文库方案一致。二、操作方法1.不对称PCR制备ssDNA(1)首先将筛选获得的ssDNA参照RNA文库的实验方案扩增成双链DNA，纯化回收。(2)确定不对称PCR制备ssDNA文库所需的最佳双链DNA模板量。取不同量的上述PCR产物为模板，不对称PCR扩增35个循环。不对称PCR反应体系如下：10XPCR反应缓冲液10μl，dNTP混合液8μl，5\"引物（25pmol/μl) 2μl，3\"引物（1pmol/μl) 0.5μl，dsDNA模板不定，TaqDNA聚合酶（2U/μl)1μl，加去离子水补齐至100μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；最后72°C终延伸5min。含7mol/L尿素的12%变性PAGE观察，单链DNA条带应比双链DNA的条带略为偏上，挑选出能产生大量且条带清晰的单链DNA的双链DNA模板最作为最佳量。(3)取最佳双链DNA模板量进行大量不对称PCR扩增，含7mol/L尿素的12%变性PAGE切胶纯化，然后用核酸定量仪确定ssDNA的量用于下一轮筛选。(4)在第一轮筛选中，投入的ssDNA是直接合成的。2.链亲和素磁珠制备ssDNA(1)用5\"端标记有生物素的3\"引物将筛选获得的ssDNA扩增成双链DNA，纯化回收，用SHMCK缓冲液溶解至20μl。(2)链亲和素磁珠的准备。取0.5ml链亲和素磁珠用0.5XSSC洗三遍，每次600μl，每次1min，再用SHMCK缓冲液洗三遍，每次600μl，每次1min。(3)将双链DNA与磁珠混合，再加入40μlSHMCK缓冲液，室温孵育30min（在DNA混合器上使之充分混合）。(4)磁铁吸附后弃上清，用SHMCK缓冲液洗三遍，每次600μl，每次1min。(5)加入0.15mol/LNaOH400μl，将双链DNA裂解为ssDNA，于37℃孵育15min。(6)磁铁吸附后吸出上清，并加入20μl3mol/LHCl中和其中的NaOH，调整其中的缓冲体系为1XSHMCK，0.1%明胶，12μg/μLtRNA，总体积为500μl，进入下一轮筛选。 |
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