重要要推广的品牌Nanocs， chromotek， polysciences， echelon-inc ， Bio-Rad，伯乐 ， R&D Systems， Millipore，密理博 ， Jackson， NEB，New England Biolabs ，Sigma-Aldrich，西格玛奥德里奇， Athens Research & Technology， Illumina ， Tocris ， TwistDx， Enzymatics ，酶科技，Novus，Thermo，thermofisher，赛默飞，赛默飞世尔，gibco、invitrogen，英潍捷基，ambion、ebioscience、molecular probes、ABI，Applied Biosystems、Thermo Scientific，pierce。

鸽肉含有多种氨基酸、维生素及微量元素；鸽蛋也是养生、滋补的佳品。随着国内外鸽子市场消费水平的增长，越来越多的商家投入到鸽子生产中，鸽子的繁育和发展受到了更多的关注。鸽子属于单态性鸟类，即雌雄性别在外观上表现一致。鸽子还是典型的\"一夫一妻”制的繁殖方式，如果性别比例不当，不仅会使鸽群不安定，还会影响繁殖，降低产蛋率，所以雌雄鉴别在鸽子养殖业中具有重要作用。

鸽子作为晚成鸟，雏鸽体型小且雌雄外貌形态差别甚微，不像一般家禽可以从外形上区分雌雄。因此，人们对鸽子的雌雄鉴定主要依赖分子生物学方法，而其中CHD-W基因鉴定法最为常用。CHD1(chromo-helicase-DNA binding protein-1)在非平胸鸟类的Z、W染色体都有分布，两者的外显子序列和大小相似，内含子大小却有很大差别。国内外学者根据这个特性，利用内含子两侧保守序列设计特异性引物，使用PCR方法对CHD-W进行扩增，用于多种非平胸目鸟的性别鉴定，并取得了显著进展。

然而，一方面现有的引物主要针对普遍的非平胸目鸟类，与特定鸟类的基因吻合度低，PCR效果较差；另一方面现有的引物扩增雌性两条带大小差别不大，不易区分，容易造成判断失误；而且，在鸽子基因组DNA的提取过程费时费力，还容易造成样品污染，影响检测结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种技术实用性强、重复性好、效率高的直接对血液扩增鉴定鸽子性别的方法。该方法既可节约鸽子基因组DNA提取的成本，降低样本污染的风险和假阳性的概率，又可以用于鉴别外观上难以区分性别的鸽子的性别鉴定。

本发明的目的之一是提供一种鉴定鸽子性别的引物对。该引物对为：

上游引物CHd-WL1(SEQ ID NO：1，5’CTCTGGGTTTTGACCAACTA3’)；

下游引物CHd-WR1(SEQ ID NO：2，5’ATATCTTACCGCCTGATCTC3’)。

本发明的目的之二是提供一种鉴定鸽子性别的PCR试剂盒。该试剂盒包括：所述引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、LA PCR buffer、dNTPs、PEC-1和Omni Klentaq。

最后，本发明的目的提供一种鉴定鸽子性别的方法。具体步骤如下：对NCBI数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对，确定较为保守的区域，设计一对原创性引物对，引物对名称为CHd-WL1(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和CHd-WR1(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于鸽子性别的分子鉴定。采集鸽子翅静脉的新鲜血液或者抗凝管(EDTA)收集的冻存血，利用该引物对进行PCR扩增，PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳后扩增产物为单一条带，可以判定该个体为雌性；电泳后扩增产物无条带，可以判定该个体为雄性。

与现有技术相比，本发明直接使用鸽子血液进行PCR检测，不仅节省了成本和劳动时间，还降低了样本污染的风险和假阳性的概率；在保守区域设计引物用于鸽子性别的鉴定，PCR扩增效果好，电泳检测条带清晰，结果易读，可以准确地判定鸽子性别；本发明设计引物通用性强，适用于鸽子品种包括但不限于白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽等。本发明使用血液直扩鉴定鸽子性别，是一种技术实用性强、重复性好、效率高的的方法。

附图说明

图1实施例中鸽子血液直接PCR产物电泳后的图谱；其中电泳图谱第一行：白卡1-8为白卡鸽，深王1-8为深王鸽，白王1-8为白王鸽；电泳图谱第二行：银王1-8号为银王鸽，泰森1-8为泰森鸽，B为空白对照。图中M为marker，♀为雌性，♂为雄性。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例

1、鸽子血液采集

本发明的样品来源于鸽子5个品种：白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽，每个 品种雌雄各4只。先将鸽子侧卧保定，露出腋窝处，拔去该部羽毛，可见翼下静脉，压迫翼下静脉的近心端，使血管怒张，消毒后，手持采血针由翼根向翅膀方向沿静脉平行刺入，采完后要压迫止血。采集的血液可直接检测或者抗凝管(EDTA)收集-20℃冷冻保存。

2、引物设计

对NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对，确定保守的区域，利用primer5.0设计一对原创性引物对：CHd-WL1(核苷酸序列SEQ ID NO：1 CTCTGGGTTTTGACCAACTA)和CHd-WR1(核苷酸序列SEQ ID NO：2ATATCTTACCGCCTGATCTC)，该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于鸽子性别的分子鉴定。

3、PCR扩增

20μl反应体系中加入鸽子血液0.8μl、LA PCR buffer 2μl、上下游引物各0.6μl、dNTPs 1μl、PEC-15μl、Omni Klentaq 0.3μl、ddH2O 9.7μl。其中：LA PCR buffer来自宝生物工程(大连)有限公司的10×LA Taq Buffer II(Mg2+plus)(Code No.9153A)，dNTPs购于宝生物工程(大连)有限公司(Code No.4030Q)，PEC-1增强剂购于VitaNavi Trchnology(VN260P)，Omni Klentaq直扩酶来自美国Enzymatics公司的Omni(P7500-HC-F)，ddH2O为高压灭菌的去离子水，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，工作浓度为10μM。表1是PCR的反应体系。

PCR反应条件为：98℃5min，35个循环：95℃30s，54℃30s，72℃45s，后72℃延伸5min，反应产物于4℃保存。

表1

4、性别鉴定

将PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。鸽子性别鉴定检测结果如图1所示：其中电泳图谱第一行：白卡1-8为白卡鸽，深王1-8为深王鸽，白王1-8为白王鸽；电泳图 谱第二行：银王1-8号为银王鸽，泰森1-8为泰森鸽，B为空白对照。图中M为marker，是天根生化科技(北京)有限公司的100bp DNA ladder，♀为雌性，♂为雄性。从扩增产物电泳图谱可知：扩增产物电泳为单一条带的是雌鸽，长度约370bp；扩增产物电泳无条带的是雄鸽。

5、序列分析

由于雄性鸽子不能扩增出目的条带，因此我们将经过鉴定的雌鸽样本的PCR扩增产物送华大基因测序，以验证性别鉴定的准确性。雌鸽样本的PCR扩增产物测序峰图使用Chromas软件查看，测序碱基序列结果使用DNAMAN软件查看，并使用DNAMAN软件将鸽子的测序碱基序列和NCBI数据库公布的多种鸟类的CHD1序列进行对比分析，结果显示扩增序列与参考序列有很高的一致性，说明我们扩增的序列为CHD1基因，进而说明我们设计的引物性别鉴定的结果是真实可靠的。

本发明方法技术实用性强，重复性好，效率高。直接使用鸽子血液进行PCR检测，不仅节省了成本和劳动时间，还降低了样本污染的风险和假阳性的概率。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

性能参数

产品名称：美国VitaNavi直扩PCR聚合酶英文名称：VitaNavi产品货号：VN122E VN146E等产品规格：25ul（25ul*100rxns）产品产地：美国产品商标：VitaNavi价格：550元保存与运输：-20现货状态：大量现货产品资料：实验方法技术资料 更新时间：2020/4/2 11:25:00浏览人数：3810供应商： 苏州蚂蚁淘生物技术股份有限公司诚信指数：1300点了解更多：进入公司展台使用范围：仅限科研使用，不能应用于临床

一、Klentaq1 / Klentaq LA?实例1：用Kelntaq LA扩增大于20kb的大片段基因。?

?

二、高耐受性(Inhibitor-Resistant) 聚合酶：OmniTaq / Omni Klentaq产品特征：1. 对全血、血清、血浆、土壤、植物、巧克力、奶酪和牛奶中的抑制因子具极高的耐受性，可直接对样品进行PCR检测，无需进行DNA分离纯化。2. 可以耐受高达40% 的全血，20% 的血浆或血清，已应用于多种遗传病的分子诊断和临床检验。3. 可用于法医、环境监测、农业、动植物检疫和临床诊断等领域。4. 可以从人血液中一步扩增疟疾基因。5. 与PCR增强剂结合使用时，其耐受性将进一步提高。6. 使用Omni 酶不仅节省时间、降低成本，而且实现了从微量样品中的扩增，避免因提取过程所致的DNA丢失或污染。

实例 2：用OmniTaq（OT） 和 Omni Klentaq（OKT）从肝素抗凝血液中一步扩增乙肝病毒基因。?

实例 3：用新突变的Omni酶从富含腐殖酸的人基因组中扩增1.1kb的CCR5基因。?

实例 4：用新突变的Omni酶从巧克力和黑胡椒中直接扩增基因。

?三、热启动聚合酶(Hot-start) 聚合酶：Cesium Taq / Cesium Klentaq产品特征：1. Cesium Taq 和Cesium Klentaq是一种冷敏感的突变体，在室温条件下聚合酶的活性很低，当升高温度进入PCR循环时聚合酶的活性就全部释放出来，因而具有内置式热启动功能。2. 与现有化学修饰或抗体封阻的热启动聚合酶相比，Cesium Taq 和Cesium Klentaq的聚合酶活性更高，扩增效果更好。3. Cesium Klentaq具有热启动和高耐受性双重效果。

实例 5：用Cesium Klentaq扩增基因热启动效果比较

?四、PCR增强剂（PCR enhancing cocktails, PEC）产品特征：1. 联合使用PEC-1 或 PEC-2与高耐受性Taq酶（OmniTaq and Omni Klentaq）可以更好的克服样品中各种物质对PCR反应的抑制作用，进一步提高PCR扩增效率，简化PCR操作流程提高。2. PEC有助于从基因组中扩增GC含量高达80%的基因。3. PEC也可用于qPCR（SYBR和Taqman probe）。4. 新研发的PCR增强剂PEC-3 and PEC-4有助于从食品中扩增基因。

?

实例 6：联合使用Omni Taq or Omni Klentaq及PCR增强剂（PEC）从不同类型的牛奶中检测沙门氏杆菌 Inv 基因。?

?

实例 7：联合使用Omni Taq or Omni Klentaq及PCR增强剂（PEC）从人的基因组DNA或全血中直接扩增3个高GC含量的基因。?

五、各种特异性一步PCR试剂盒VitaNavi Tech公司开发了系列一步法PCR和qPCR试剂盒，可以直接从样品中扩增目的基因。

1. Direct Blood PCR Kit： 从血液中直接扩增目的基因

实例 8：使用Direct Blood PCR Kit从全血中一步扩增CCR5基因

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