做了快7年的分子克隆，从加样加不好，到现在轻松PCR，我想分子生物学这块还是有很多经验可以分享一下的。
或许很多人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。
通俗地说，很多人用了很多软件设计来设计去，又是考虑发夹结构，又是考虑二聚体，又是考虑Tm值，折腾来折腾去，但其实没那么复杂。首先保证你要的基因是正确的，这个可以从NCBI中找到，大部分是没问题的，然后再找到起始密码子，从那开始大概上游取20-27bp，加上酶切位点，加上保护碱基（一般3个）就是上游引物，取后20-27bp碱基，反向互补，加上酶切位点和保护碱基组成下游引物。这样引物设计就完成了，可以放到软件里看看GC含量，Tm值，发夹结构，二聚体等，适当调整碱基个数和保护碱基的个数。需要额外注意的是移码问题。
需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种，连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。
3，提质粒
有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。
4，酶切
用于连接的酶切很关键。需注意如下几点：
①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。
②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。
③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。
④酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切。
5，回收
回收可以用柱式试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，沉淀用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解。次方法优点是对DNA和黏性末端的损伤最小，缺点是容易损失DNA。若本来DNA数量就不多，用手工法很容易丢失殆尽；如果DNA量很大可以考虑使用。
回收后要电泳，一来估算回收液浓度，二来看回收DNA的质量。若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。因为条带拖痕表示它已碎裂成比它小的各种长度的片段，而主带虽然还在那个位置但也已遭到一定程度的破坏。质量不好的回收产物做连接成功率会降低，假阳性克隆会增加。造成回收质量差的原因可能是回收这步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出现酶切④所描述的情况，就容易造成回收质量不好。只有回收到清晰、利索的条带，才不影响连接。
6，感受态
做连接要求感受态的效率要高。感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱，而且每次开－80℃冰箱温度微升对感受态效率都有一定影响，久而久之效率就不行了，这就要求大家取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。都知道感受态效率高好，但麻烦的是感受态效率的高低不好通过实验来检测，因为若通过转质粒来检测，只要是效率中等的感受态都能长出很多克隆。所以如果你们的感受态已经储存了很长时间或者连接长的克隆连续几把都太少就要重做感受态了。制备感受态不推荐新手直接去做，最好由经验丰富者做或他带你做。用新做的感受态转质粒，用同样手法用量，你会发现比旧感受态明显多长很多克隆。
7，连接
最后才轮到连接。连接的问题讨论的是比较多的。如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。
①DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成。当然如果你的DNA质量好，DNA用量越大连接效率越高。就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了。
②vector和insert的比例：如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的几倍长，可以用1：3－1：9。如果insert较长（3、4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector还长，可以用1：1－1：3。短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。长片段的连接效率较低，阳性克隆率小于等于10％是很正常的。我做过一个长片断的连接，6k的vector、6k的insert，比例用1：1，挑了20个克隆有一个对。
③体系体积：通常用20ul都能连上，若连长片段可以压缩成10ul（前提是DNA数量不变）。我觉得体系不是很关键，有位很精通克隆的老师说他都用50ul体系，照样百发百中。而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的，体系中不加水也行。前述我自己连的长片段也是用20ul体系，vector和insert各上8ul。
④T4连接酶：酶这东西自然是越贵越好，一分钱一分货，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接，强烈建议买好的。我用过Promega的，还好；BBI的凑合用。如果连长片段就加二倍的连接酶。
⑤连接时间：过夜。过夜就应该足够了，但是你要是不急着转化放到4度放几天也行，我个人认为时间长只好不坏。
⑥连接温度：最适是16℃。有人用PCR仪造16℃，我用泡沫冰盒加凉水再添冰，用手感觉差不多十四五六度，然后盖盖过夜，基本上温度不太变。你若感觉好不温度，拿个温度计测也行。有人用4度连接，也行，我有时先16度过夜，再放4度里几天。
⑦转化：连接的转化不能像转质粒那么随便，要小心翼翼，尽量作到不放弃任何一个菌。一般所用的感受态体积最少是连接体系的5倍。长片段的连接转化时摇菌2小时。
⑧对照：对照很关键，可以反应出很多重要的信息，不要懒，你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照。一般有如下几种对照方式：
⑴转化质粒对照。和连接产物同样抗性、一起转化、涂在同一个板上。这个对照目的是检测转化系统是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量，看长的菌落数，若明显太少就要怀疑感受态）。还有一个作用，如果质粒早就长出来了，都长挺大了你的连接产物还没动静呢，那八成是没戏了，别等了赶快去准备下次连接的材料吧。
⑵切完回收的vector直接转化对照。如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大，或跑电泳这两种跑不很开，就要做这个对照。目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在。长不出克隆是对的，若长出克隆，好好改进你的酶切系统吧。
⑶切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照。双酶切的，最好要做这个对照，而且这个对照长的克隆要挑若干提质粒。一、若切完的目的vector和没切的vector的长度相差较大，电泳条带离的远，这个对照能检测酶切和回收的质量。如果DNA末端遭破坏或断裂，会随机产生各种末端，这些末端少数能连接到一起，长度上小于等于回收的vector。二、若切完的vector和没切的vector的长度相差不大，这个对照除了检测\"一”中所说的还检测是否有只进行了单酶切的。总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤吧。
如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率会较高，但也不能保证一次成功。在确保各步骤产物质量都不错的前提下若重复3、5次还没连上就要回头仔细检查这个克隆的策略有没有问题了，要是策略就有毛病你还懵然不觉那可就怎么做也做不出来了。
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