在体外通过各种方法对造血干/祖细胞进行扩增的结果是使造血干细胞成分，各系列祖细胞和成熟细胞为主的各阶段造血细胞的数量都得到了扩增，即在造血干/祖细胞扩增的同时也发生了分化。这是造血干/祖细胞扩增所面临的难题。我们可以利用造血干/祖细胞的多向分化潜能，通过细胞因子的不同组合，定向诱导其分化，从而产生大量功能细胞，如红细胞、树突细胞、淋巴细胞等以满足基础研究及临床应用的需要。作者：裴雪涛,本实验来自「干细胞实验指南」
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造 血 干 /祖 细 胞 的 分 离 纯 化
分离造血干细胞的常用技术是利用细胞的表面标志进行磁性激活的细胞分选 (magnetic activated cell sorting， MACS)。在造血干细胞的众多表面标志中， CD3 4 是最常用的标志性分子， CD34 分子是一种跨膜的唾液黏蛋白，在造血干细胞、一部分造血祖细胞、血管内皮细胞以及胚胎成纤维细胞表面表达。虽 然 CD34+细胞不全是造血干细胞，但是所有的造血干细胞均应表达 CD34 分子，所以临床和基础研究多是基于对 CD34+细胞的筛选来富集造血干/祖细胞的。近年来应用胎羊免疫缺陷小鼠移植模型进行的相关研究表明，将一群不表达 CD3 4 分子的 Lin_CD34-细胞移植到条件受者后，也能重建接受者的长期多系造血及免疫功能。这 群 LirTCD34-细胞是比 CD34+造血干细胞更原始的前体细胞。本实验室已经建立了两步法负性筛选 LirTCD34-细胞 (白慈贤等 2003) 及 正 性 筛 选 CD34+细胞的技术。此外 ， CD133 分子 (Miraglia etal.1999)、 KDR 分子 (Ziegler etal.1999) 等也被用来分选造血干细胞，其分离步骤与 CD34+细胞分选步骤基本相同，这里就不详述了。
免 疫 磁 珠 方 法 分 离 C D 34+细胞MACS 是 2 0 世 纪 9 0 年代初兴起的一种分离细胞的新型技术，人们可以运用该技术在短时间内 ( 2 h)高 效 分 离 CD34+细胞。整个分离过程依赖于一个可以特异性识别造血干/祖 细 胞表面CD34 抗原的抗体，该抗体与磁珠相连，当细胞群(与抗体、磁珠孵育后)通过磁场时，细胞-抗体-磁珠复合物就可以被磁场捕获，而阴性细胞群则会流出磁场。
1 ) 实验所需仪器及材料
调温低速离心机；
超净工作台；
二氧化碳孵育箱；
电子天平；
流式细胞仪 ；
普通光学显微镜；
MACS 磁性分离仪、分离柱；
MACS 磁性细胞分离试剂盒(抗 CD34 抗体、磁珠);
脐带血、外周血或骨髓;
PBS 缓冲液；
甲基纤维素；
BSA;
EDTA;
淋巴细胞分离液；
离 心 管 、吸管、培养板等。
2) 单个核细胞的分离(mononuclear cell， MNC)
⑴ 肝 素 抗 凝 的 脐 血 、骨髓或动员的外周血按 I : 1 的比例与P B S 混 匀 ，再 按 4 : I的比例与 0 . 5 % 甲基纤维素混匀，室温 静 置 30 min，待红细胞自然沉降至界限分明。
⑵ 吸 出 上 清 ，置 于 50m l 离心管中， 2 0 ℃ 、 1500r/min 离 心 5 min。
⑶ 弃 上 清 ，力口5 ml PBS重悬细胞。
⑷ 先 在 IOmI 离心管中加入 5m l人淋巴细胞分离液 (FicollHypaque 液)，再缓慢沿管壁 加 入 5m l 细胞悬液， 20℃ 、 1500r/min 离 心 20 min，可以看出液体由上至下分成PBS、MNC、 Ficoll-Hypaque 液 、红细胞共 4 层 。
(5) 收集界面单个核细胞，用 P B S 洗涤。
(6) 用 PBS悬浮细胞计数，备用。
3) CD34+细胞的分离纯化
(1) 用 3 0 0 0 分离缓冲液悬浮单个核细胞，分 别 加 人 CD34+细胞分离试剂盒中的试剂 A l(非特异性阻断抗体)、 A2(CD34特异性单抗QBEND-10)各 100 ul，轻轻混勻，冰上孵 育 20 min。
分离缓冲液： PBS、 0.5% BSA、 2 mmol/LEDTA。
(2) 力口500ul分离缓冲液， 4℃ ；3000r/m i n 离 心 3 min，弃上清。
(3) 用 400ul 分离缓冲液悬浮细胞，加入试剂B (结合50n m 磁 珠 的 IgG)100ul，轻轻混勻 ，冰上孵育 20 min。
(4)加500ul分离缓冲液， 4℃ ,3000r/min离心3分钟, 弃上清。
(5) 再 用 Iml 分离缓冲液重新悬浮细胞，制成单细胞悬液。
(6) 将分离柱固定于 M A C S 磁场内，用 2m l 分离缓冲液冲洗分离柱。
(7) 将单细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡；用 2m l 分离缓冲液洗涤。
(8) 将分离柱移出磁场，用 Im l 分离缓冲液加压洗脱，收 集 lin-CD34+细胞的组分，进行细胞计数 ，备用。
4) CD34+细胞纯度的检测
(1) 取 IxlO5 分 离 的 CD34+细胞， PBS离心洗涤后用1000 PBS重悬。
(2) 加 入 PE 标 记 的 CD34单克隆抗体20队 4 1 孵 育 30 min。
(3) PBS 洗 涤 2 次 ，重 悬 于 PBS， 流式细胞仪检测。
5 ) 结果
16份脐带血标本的体积、分离的单个核细胞及CD34+细胞数量等结果见表4.1(本实验室数据)。所采集的脐带血标本的体积和细胞含量有显著的个体差异。经 M ACS分离纯化后， CD34+细胞纯度可达 85%〜 98% 。
6 ) 注意事项
(1)注意无菌操作。
(2)收 集 的 脐 带 血 在 分 离 前 最 好 保 存 在 代 ，时间不超过 4 h 。
(3) 收集的骨髓细胞在分离前最好保存在4℃; 分选前，先将样品过30 Mm 的筛网以去除细胞团等。
(4) 收集的外周血在分离前最好保存在4°C ，时间不超过8 h 。
(5) 在分离单个核细胞前应尽量去除红细胞。
(6) 与 A l 、 A 2 、 B 试剂的孵育时间要充分，以使抗原抗体及磁珠能有效地结合。
(7) 在标记过程中，升高温度或延长孵育时间，可能会增加非特异性反应。
(8) 操作中，要避免细胞悬液中产生气泡，应尽可能使用脱气的分离缓冲液。
(9)如果样品中出现血小板凝集或血小板黏附在细胞上的情况，可通过低速离心(200s 离 心 IOmin)去除血小板。
Lin- C D 3 4 - 细胞与 Lin- C D 34+ 细 胞 的 分 离
根据造血干细胞的表面特征： CD34+、 CD3- CD7- CD8- CDlO- CD14- CD15-CD19+、 CD2 0 + CD33+(其中 CD10、 CD19、 CD20 是 B 淋巴细胞的标志， CD3、 CD7 、CD8 是 T 淋巴细胞的标志， CD14、 CD15、 CD3 3 是成熟髓细胞的标志)，可以通过去除成熟细胞的负筛选方法对造血干细胞进行富集。不想要的成熟细胞被相应的抗体和胶体磁珠颗粒标记，在通过磁场时与分离柱结合而被留在磁场内，收集流出液即为相对处于早期的干/祖细胞 (Lin- 细胞)。 Lin- 细胞可进一步用来筛选CD34+或 CD34-田胞。
实验所需仪器及材料 ，
参 考 「免疫磁珠方法分离 CD34+细 胞 」 的内容。
造 血 干 /祖 细 胞 的 扩 增 基 质 细 胞 支 持 的 造 血 干 /祖 细 胞 扩 增
Dexter等 在 1977年建立了骨髓液体培养体系。此培养法的基础是建立骨髓基质细胞支持层 (包括成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和网状细胞等)，形成二维空间结构，该培养体系不但提供了营养、细胞因子，而且提供了类似于体内的细胞-细胞关系 ，通过模拟体内造血微环境，实现造血干细胞的长期培养。我们可以根据实验需要自行分离培养骨髓基质细胞，或购买已经建系的基质细胞，如 MS-5s HESS-5等 。
1.实验所需材料
成人骨髓或小鼠基质细胞系；
IM D M 、 α-M E M ;
马血清、胎牛血清；
β-巯基乙醇；
氢化可的松；
造血生长因子F L 、 S C F 等 ；
明胶；
胰酶；
离心管、吸管 、培养板等。
2.成人骨髓基质细胞的培养
(1) 取自无血液病或原发病未涉及骨髓的有核细胞，悬浮于长期液体培养体系(longterm culture medium， LTC-medium）中 ，种入 T-25 cm2组织培养瓶中 ，培养 3〜 4 周 ，每周半量换液，并洗去未贴壁细胞。
长期液体培养体系： I M D M 、 12.5 % 马血清、 12.5% 胎牛血清、10—4mol/L β-巯基乙醇 、 l06mol/L 氢化可的松。
(2) 待细胞生长至8 0 % 〜 9 0 % 汇合后，可收集基质细胞，冻存于液氮中。直至共培养一周前，复苏细胞。
(3) 在共培养之前的72 h ，用 15 Gy γ射线照射骨髓基质细胞。
⑷ 照 射 后 48 h ，用 0 . 2 5 % 胰酶消化细胞，并 以 6xl04〜 8xl04 个/m 2 密 度 接 种 于 24
孔板中，经 24 h 重新贴壁后即可用于共培养。
3.小鼠基质细胞系的培养(Is+saad et al.1993)
(1) 将 M S -5基质细胞系培养于添加了 10% 胎牛血清的a_M E M 培养液中。细胞生长汇合后，仍可以维持数周，不需要传代培养。
(2) 共培养前，为防止基质细胞提前脱落，可 预 先 用 1 % 明 胶 包 被 2 4 孔 板 ，随后将未照射的 M S -5细胞 按 4xl 〇 4个/m l 的密度铺于 2 4 孔板中。
4.共培养
(1) C D 34+造血干细胞的分离纯化 (见本节第一部分内容)。
(2) 按 2xl 〇 3〜 5xl03 个/m l 密度将造血干细胞接种于预先铺有基质细胞的2 4 孔板中，添加长期液体培养体系，或添加造血生长因子如F L 、 S C F 等。
(3) 将细胞置于 5 % C O 2, 饱和湿度的3 7 ¾ 孵箱中培养。每周半量换液。
(4) 每周做细胞计数，流式细胞仪检测C D 3 4 分子的表达情况及造血集落分析(具体步骤见下文) 等，以评估共培养体系对造血干/祖细胞的扩增效果。
细 胞 因 子 支 持 下 的 造 血 干 /祖 细 胞 扩 增 很多造血生长因子 (hematopoietic growth factor,H G F ) 对造血干/祖细胞的增殖分化都具有重要的调控作用。这些因子包括S C F 、 F L 、 IL-6、 IL-11、 IL-12、 LIF、 G -C S F 和 T P O等 。人们通过实验证明多因子组合对于造血干/祖细胞的扩增是非常必要的。但由于不同
来 源 、具有不同表面标志的分离的造血干/祖细胞对细胞因子的反应有所不同，而可扩增造 血 干 /祖 细 胞 的 因 子 又 很 多 ，所 以 人 们 尝 试 的 细 胞 因 子 组 合 也 比 较 多 。下述方案(Gammaitoni et al.2003) 是扩增造血干/祖细胞效果较好的方案之一。
1.准备以下材料和试剂
成人骨髓或小鼠基质细胞系；
I M D M ;
胎牛血清；
造血生长因子F L 、 S C F 、T P O 、 IL-6 等 ；
MethoCult™ G F +H 4435 培养基；
MyeloCult H 5100 培养基；
氢化可的松；
胰酶；
小鼠抗人C D 3 4 单克隆抗体；
离心管、吸管、培养板等。
2.CD34+ 造血干/祖细胞的分离纯化
见本节第一部分。
3.细胞培养
按 2x l03——5x l 〇3 个/m l密度接种 CD3 4+细 胞 于 2 4 孔板中，添加扩增培养液 (lml/孔)。
将细胞置于 5 % CO2, 饱和湿度的37℃孵箱中培养5 周 。
造血干/祖细胞扩增培养液： IMDM、 1 0 % 胎牛血清、 SCF 50ng/ml、 FL 50ng/ml、TPO 10ng/ml、 IL-6 10ng/ml
4.细胞计数及检测
每周半量换液。并做细胞计数，流式细胞仪检测C D 3 4 分子的表达情况等。
5.造血祖细胞集落分析
⑴ 配 制 培 养 体 系 ：自行配制，或使用公司提供的甲基纤维素培养基MethoCult™GF+H4435(Stem Cell Technologies)
甲基纤维素培养基： I M D M 、 1.0% 甲基纤维素、 3 0 % 胎牛血清、 1 % 牛血清白蛋白、lO-4nol/L β-巯基乙醇、 2 mmol/L 谷 氨 酰 胺 、 SCF 50ng/m l 、 GM-CSF 20ng/m l 、 IL-320ng/ml、 IL-6 20ng/ml、 G-CSF 20ng/ml、 Epo 3U /ml
(2) 接种扩增前的 C D 34+ 细胞 (IxlO3 个/ml)、扩增后的细胞 (5xl04 个/ml), 于 5 % C 0 2、
饱和湿度的37¾: 孵箱中培养 2 8 天。
(3) 在 培 养 14〜 2 1 天时，对集落形成单位总数(total colony forming unit in culture,C F U -C ) 进 行 计 数 ，包 括 粒 -巨 嗤 细 胞 集 落 形 成 单 位 (cl 〇 ny forming unit-granulocyte/macmphage， C F U -G M ，在 20x解剖显微镜下检测半透明细胞数多5 0 的集落数)，红系爆式集落形成单位(burst-forming unit-erythroid， B F U -E ) 和多系或混合集落形成单位(clony
forming unit-mix , clony forming unit-granuloid/erythroid/macrophage/megakaryocyte ,C F U -Mix/C F U -G E M M )，在 第 2 8 天 计 数 高 增 殖 潜 能 集 落 形 成 单 位 (high proliferativepotential-colony forming unit， H P P -C F U X 检测细胞数 50 000、直径 0.5m m 的致密大集落)。
6.LTC-IC (long term culture initiating cell) 分析
⑴ 骨 髓 基 质 细 胞 的 培 养 ：见 步 骤 「3) 细胞培养」。
⑵贴壁骨髓基质细胞铺满瓶底后，用 15 Gy γ 射线照射细胞。
(3) 用 0.25% 胰酶消化细胞，并 以 7x l 〇 3 个/cm2 的密度接种于 2 4 孔板中，经 24〜 48 h重新贴壁后即可用于共培养。
(4) 向已铺好基质细胞层的孔中加入扩增前的细胞 5x l03 个 或 扩 增 后 的 细 胞 IxlO3个 ，培养液可选择 MyeloCult H5100(Stem Cell Technologies) , 并添加 10-6mol/L 氢化可的松。每周半量换液。
(5) 培 养 5 周 后 ，用 0 . 2 5 % 胰酶消化细胞，收集所有细胞洗涤 1 遍后，按上述集落培养方法进行造血细胞集落分析，第 14 天对所有集落进行计数，即为 LTC-IC。
7.结果
纯 化 的 CD34+细胞在体外扩增培养体系中培养 14 天后，细胞总数、 CD34+及 CD34+CD38- 亚群均有不同程度的扩增。培养 至 第 8 周 ，成人骨髓来源的造血干/祖细胞可扩增90〜 10 000 倍 。扩增后的细胞具有很好的集落形成能力。培 养 至 第 10 周时成人骨髓来源的造血细胞的集落形成细胞总数扩增了 50〜 5000 倍 。LTC-IC 数量从培养第一周开始就有明显的增加，培 养第 4 周的细胞的 LTC-IC 可 扩 增 7.4 倍 ， 5 周 时 扩 增 11.3 倍 。
造 血 干 /祖 细 胞 的 体 外 分 化 造 血 干 /祖 细 胞 向 红 系 定 向 诱 导 分 化
造血干/祖细胞具有极强的自我更新及向各系血细胞分化的能力。在体外要促使造血干/祖细胞向红系细胞分化，需要尽可能模拟体内的微环境。本实验室采用两阶段诱导的方法，获得了以晚幼红细胞为主的红系细胞。体 外 诱 导 分 化 的 14〜 2 1 天为细胞生长峰期，细胞总数可增加 1028.6±228.4(n=10) 倍，红系的诱导效率可达 (52.3±12.4)%。尽管实验表明造血干/祖细胞很容易分化为红系细胞，但在体外却很难实现分化细胞的成熟脱核。最近有研究结果显示，如果以减少扩增的细胞数为代价，也可能获得成熟
的红细胞 (Carlile et al. 2004)。而如何大规模的生产成熟的红细胞以满足临床输血需要这一问题就成了一个难题。 Giarratana 等研究人员 (2005) 提出了一个改进的技术方法，即通过尽可能的模拟骨髓微环境 (应用细胞因子及与基质细胞共培养) 的方法实现了造血干祖细胞的持续扩增及 1 00% 的分化为成熟的红细胞。这种方法适用于骨髓、 G-CSF动员的外周血、脐带血来源的造血干/祖细 胞 ，也适用于胚胎干细胞分化的红系祖细胞
(Carotta et al.2004)
材料和试剂
成人骨髓基质细胞或小鼠基质细胞系；
IMDM;
氢化可的松；
造血生长因子S C F 、 IL-3、 E P O 等 ；
B S A ;
转铁蛋白；
硫酸亚铁；
硝酸铁；
胰岛素；
PBS缓冲液；
FITC-C D 7 1 单克隆抗体；
核 酸 染 料 L D S - 7 5 1 ;
台 盼 蓝 染 液 ；
吉姆萨染液；
离 心 管 、吸管、培养板等。
CD34+造血干/祖细胞的分离纯化
见本节第一部分。
CD34+造血干/祖细胞向成熟的红细胞分化 (分三阶段进行诱导分化）
1 ) 第一阶段 (〇 〜 8 天）
(1) 按 IO4 个/m 2 的密度接种C D 34+ 细胞于无血清培养液中，并 添 加 l0-6 m 〇 I/L 氢化
可的松， SCF 100ng/m l ， IL-3 5ng/m l ， E P O 3IU/ml。将细胞置于 5 % C 0 2、饱和湿度的37℃孵 育 箱 中 培 养 。
无血清培养液： I M D M 、 1 % B S A 、转 铁 蛋 白 120ug/ml、硫 酸 亚 铁 900ng/ml、硝酸铁 9 〇 ng/ml、胰岛素 lOug/ml。
(2) 培养至第 4 天 ，将上述培养的细胞按 1 :4 传 代 ，培养条件不变。
2 ) 第二阶段 ( 3 天）
⑴ 基 质 细 胞 的 培 养 (见 4.1.2.2 中 步 骤 「 3) 细胞培养」）。
(2) 将第一阶段培养的细胞按 5xl 〇4 个/ml、 2XlO
5 个/ml、 3xl05 个/m l 的密度 (分另崃
源于脐带血、骨髓、外周血) 接种于预先铺有基质细胞层(M S - 5 或成人骨髓基质细胞) 的培养瓶里，在 含 有 3 IU/ml E PO 的无血清培养液中继续培养 3 天 。
3) 第三阶段 (10 天）
经上一阶段的诱导分化后，去除细胞因子，添加无血清培养液，使造血细胞继续与基质细胞共培养 10 天 。
4 ) 检测
(1)对诱导分化不同天数的细胞进行吉姆萨染色，观察胞核形态变化；并利用台盼蓝染色计算出活细胞的比率。
⑵ 细 胞 表 面 标 志 分 析 ：
a.收集分化不同天数的细胞，用 P B S 洗涤细胞。
b. 将 FITC-C D 7 1 单克隆抗体或 FiT C -IgG1 抗体 (作为阴性对照伽入 p B s 悬浮的细胞中，冰上孵育 30 min。
c.用 P B S 洗 涤 细 胞 3 次 。
d. 用核酸染料 LDS-751 对细胞染色。
e. 用 PBS洗涤 细 胞 3 次 。
f. 将细胞重悬于5000 PB S 中，用流式细胞仪检测。
(3) 血红蛋白分析，变形能力检测及体内实验验证等可参考文献报道 (Giarratana et al.2005)。
5 ) 结果
造血干细胞经细胞因子及基质细胞的共同诱导分化后，其细胞数量可扩增 1.95xl06 倍 ，分 化 第 15——18 天 ，细胞核开始消失，细胞表面的转铁蛋白受体 C D 7 1 逐渐丢失，造血 干 细 胞 100% 分化为成熟的有功能的红细胞。这些分化的红细胞具有天然红细胞的功能特点，如细胞膜变形能力、携氧能力等。
Sui 等 (1999) 的研究表明， C D 34+ 细胞可被分为两个细胞亚群： IL-6R+ 和 IL-6R- 的细胞 。 IL-6R+ 细胞能被刺激而形成粒-巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞；而 IL-6FT 细胞当被给予 IL-6 河 溶 性 IL-6 受体 (SIL-6R ) 时则可形成红系及巨核系细胞，从而得出结论，即巨核系祖细胞存在于 IL-6R -的细胞群中。我们实验室利用上述特点采用免疫磁珠两步分离法
建立了一种巨核系祖细胞的分离方法。用 该 方 法 分 离 获 得 的 细 胞 在 体 外 加 入 T P O 、SIL-6R 、 S C F 等细胞因子组合培养 14 天后， C D 41/C D 6 1 双阳性细胞可达 6 0 % 以上 (以往的方法为 3 0 % 左右)，大大增加了巨核细胞的诱导效率，为该方案的临床实施奠定了基础。
材料和试剂
①脐带血、外周血或骨髓；
② MACS 磁性分离仪、分离柱；
③ MACS磁性细胞分离试剂盒 ( Lin- 细胞分选、 CD126+ 细胞分选)；
④ P B S 缓冲液；
⑤甲基纤维素；
⑥ B S A ;
⑦ EDTA;
⑧淋巴细胞分离液；
⑨ IMDM;
⑩ SCF、 TPO、 IL-6、 SIL-6R 等 ；
⑪ 胰岛素;
⑫ 转 铁 蛋 白 ；
⑬ A 巯基乙醇；
⑭ L -谷氨酰胺；
© 叶 酸 ；
⑭ 维 生 素 B 12;
⑫ 瑞氏染液;
⑬ P E -C D 41、 FITC-C D 6 1 鼠抗人单克隆抗体；
@ 离 心 管 、吸管、培养板等。
Lin- 细胞的分离
参 考 「Lin-CD34-细 胞 与 Lin-CD34+细胞的分离」中的内容。
Lin-/CD126-细胞的分离
巨核系祖细胞的分离纯化， Backman Coulter 公司免疫磁珠分离系统。
(1) 取 抗 C D 126 抗体 (抗 IL-6 受体的抗体) 工作液 5 0 0 与 5 0 0 免疫磁珠混勻， 4℃孵育 30 min。
(2) 将分离的 L in- 细胞与上述混合物混匀， 孵 育 30 min。
⑶ 将 细 胞 与 抗体的混合物置于5m l分离管内，充分混匀，置 于 Backman Coulter 磁架上室温静置，直到磁珠贴于磁场一侧、试管内液体清亮为止。
⑷在磁场内轻轻将液体吸出，其中的细胞为 Lin- CD126- 田胞。
(5) 贴于管壁的细胞即为Lin- CD126+细胞。
(6) 将收获的 Lin-CD126-田胞加 PBS 缓冲液混匀，用于细胞计数及巨核细胞的定向诱导分化。
向巨核细胞定向诱导分化
1.配制诱导分化液
诱导分化液： I M D M 、 S C F 100ng/ml、 T P 0 4U /ml、 IL-6 100ng/mI、 sIL-6R 200ng/ml、
2 % B S A 、胰 岛 素 l 〇 ug/ml、转 铁 蛋 白 200ug/ml、β-巯基乙醇 0.01 mmol/L 、 L -谷氨酰胺2m g /ml、叶酸 50ng/ml、维生素 B 1250ng/ml
2.细胞接种
将分离得到的Lin-/CD126-细 胞 按 2x l 〇 4个/m l 的浓度接种于 2 4 孔板中，在 37℃：、
5 % CO2 及饱和湿度的培养箱中培养 14 天。设 Lin-/CD126+细胞作为对照组。
3.细胞收集及分析
每 3 天半量换液。第 7 天 及 第 14 天收集部分细胞用于细胞计数及巨核细胞表型分析。
4.结果检测
(1) 细胞表面标志分析：
a. 先 用 PBS 缓冲液对收集的细胞进行洗涤。
b. 将 PE-CD4 1 ， FITC-CD6 1 单 克 隆 抗 体 加 入 P B S 悬浮的细胞悬液中，以加入PE-Ig G l 及 FITC-Ig G l 标记的抗体的细胞作为阴性对照。冰上孵育 3 〇 min。
c.洗涤细胞，流式细胞仪检测。
(2) 细胞形态学分析：常规瑞氏染液染色，普通光学显微镜下观察并摄片。
5.结果
对 分 离 Lin-细胞前后的细胞进行计数，可 统 计 出 Lin-细 胞 占 M N C 的比率约为(0.66±0.33)%(« = 6)。通过流式细胞仪分析， IL-6R-细 胞 占 Lin-细 胞 的 3 2 % 〜 4 3 % 。由此方法可从一份胳带血中分离出巨核系祖细胞 (Lin_CD126-细胞) 约 (8.32±2.17)x l 〇 5 个 (该方
法已申报国家发明专利，授权号： ZLOl 120150.9)。 Lin-/CD126-细胞在 IL-6/SIL-6R 等的作 用 下 ，使 其 细 胞 总 数 在 培 养 的 第 7 天可扩增 35.2±2.8 倍，培 养 至 1 4 天时可扩增94.5±13.0 倍，流式细胞仪检测结果表明 CD4 i a+/CD61+细淑巨核系细胞) 比例可达 6 7 % (图
4.1)。与 Lin-CD126+ 细胞相比，无论在细胞扩增的倍数上，还 是 在 CD41a+ /CD61+ 广细胞所占的比例上， Lin-/CD126- 细胞组均优于 Lin-/CD126+细胞组 (P 〇. 〇 5)。形态学观察可见典型的巨核细胞 (图 4.2)。
分化尝 试 诱导造血干 /祖 细 胞向粒系细胞分化 ，不但可以为临床成分输血提供大量的粒细 胞 ，还可以为对分化过程中的分子调控机制的进一步研究提供一个很好的模型。本实验室根据不同细胞因子的作用，摸索出利用
S C F +IL-6+IL-3+G -C S F 的组合，可以诱导脐带血造血干/祖细胞向粒细胞分化，分化效率达 6 4 % 。出于临床应用的考虑，我们利用混合脐带血浆代替了常规造血细胞体外培养所应用的牛血清及马血清，获得了满意的结果 ，其意义在于一方面节约了应用成本，另一方面则避免了由于异种血清造成的免疫反应。
1.材料和试剂
I M D M ;
胎牛血清、马血清；
S C F 、 IL-3、 G -C S F 、 IL- 6 等 ；
P E -C D l l b 、FITC-C D 1 6 鼠抗人单克隆抗体；
大 肠 杆 菌 J M 1 0 9 ;
L B 培养基；
生理盐水；
甲醇 ；
台盼蓝；
瑞氏染液；
碱 性 美 蓝 液 。
2.CD34+ 造血干/祖细胞的分离纯化
参见本节第一部分。
3.向粒系细胞定向诱导分化
⑴将分离得到的造血干/祖细胞按 2xl05 个/m l 的密度种入 2 4 孔板中，添加培养液：I M D M 培养基含 1 5 % 胎牛血清及 1 5 % 马血清。培养体系中加入以下 4 种细胞因子:50ng/m SCF、 2ng/mlIL-3、 40ng/mlG-CSF、 20ng/mlIL-6。将细胞置于 37℃ 、 5%CO2 及饱和湿度的培养箱中培养。
(2) 每 2 天加细胞因子一次，每周半量换液。
(3) 经第一阶段培养 7 天后，细胞因子改为每 2 天只加一次 40ng/ml G -C S F 。
(4) 每 2 天取样品对有核细胞进行计数，并利用台盼蓝染色计算出活细胞的比率。
(5) 检测。
a. 细胞表面标志分析：
i. 收集细胞，用 P B S 缓冲液洗涤细胞。
ii. 将 PE -C D l l b ， FITC-C D 16 单克隆抗体加入 P B S 悬浮的细胞悬液中，以添加PE-IgGl 及 FITC-IgGl 抗体的细胞作为阴性对照，冰上孵育 30 min
iii.用 P B S 缓冲液洗涤细胞以去除未结合的抗体，重悬细胞后上流式细胞仪检测。
b. 细胞形态学分析：常规瑞氏染液染色，普通光学显微镜下观察并摄片。
c. 粒细胞吞噬细菌功能测定：
i.将大肠杆菌 J M 109 接种 于 L B 培养基中，放 3 7℃摇床振荡培养 4 h 左右。
ii. 将上述菌液置水浴中 (I O O ℃ 伽 热 IOmin，目的是杀死细菌。
.
iii. 用无菌生理盐水稀释成 6x IO8 个/m l 备用。
iv . 取诱导分化的粒细胞按IxlO8 个/m l 浓缩。
V. 取 5 〇 ul 细 胞 悬 液 ，加人洁净凹玻片的凹孔内，轻轻搅动混勻，再加上述菌液 20 ul 充分混匀。
Vi.置入铺有湿纱布的有盖容器内 (此容器先放 37T 温箱中预温)，在 3 7℃ 温箱中作用 30 min，其 间 每 隔 IOmin 摇匀一次。
vii.作用完毕，取 1 滴混合液置于洁净无油污的载玻片一端，推成薄片。
viii. 待干后，用甲醇固定 4——5 min，碱性美蓝液染 2〜 3 min，置油镜下观察。
ix. 随 机 计 数 100 个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的白细胞数，对有吞噬作用的白细胞，应同时记录所吞噬的细菌数，将 1 0 0 个中性粒细胞吞噬的细菌总数除以 100, 得到每个白细胞吞噬细菌的平均数，即为吞噬指数。
(6) 结 果 ：本实验室的结果显 t k 体 外 诱 导 分 化 的 14〜 2 1 天为细胞生长峰期，细胞总数 可 增 加 l 〇〇 6.4±103.2(n = 10) 倍 ，随着培养时间的延长，细胞数量不再增加而死细胞的比率开始增加，死细胞比率达到 2 0 % 的时间为 33.0±4.0 天 (n= 1〇 )。利用粒系的特异性表面 标 志 C D l l b 进行流式细胞仪检测，结果表明粒系的诱导效率可达 (64.7±10.3)%。显微镜下可见典型的粒系细胞，其中可见许多分叶核细胞 (图 4.3)。诱导分化的细胞与大肠杆菌 作 用 30m i n 后 ，发生细菌吞噬的细胞为 35.0%，平均每个吞噬细菌的细胞内的细菌数为 5.0±3.0 个 (图 4.4)。
造 血 干 /祖 细 胞 向 树 突 细 胞 定 向 诱 导 分 化树突细胞 (dendritic cell， DC) 是功能最强的抗原呈递细胞，它在机体免疫应答过程中发挥了重要的作用。为获得大量纯化的树突细胞以满足临床需要，人们尝试从骨髓、脐带血、脾脏、外周血等部位分离C D 34+ 造血干细胞、单核细胞并将其定向诱导分化为具有较强免疫功能的树突细胞
1.材料和试剂
I M D M 、 R /M I N I 1640;
胎牛血清；
F L 、 G M -C S F 、 IL-4、 TNF-Ot 等 ；
台盼蓝 ；
PE-CD1a,FITC-CD80(B7-1)及PE-HLA-DR鼠抗人单克隆抗体；
PBS
外周血 ；
T 细胞尼龙毛柱；
淋巴细胞分离液；
丝 裂 霉 素 c ;
[3 H]-TdR;
液 闪 计数 仪 ；
离心管、吸管、培养板等。
2.C D 34+ 造血干/祖细胞的分离纯化
参见本节第一部分。
3.向树突细胞定向诱导分化
⑴将分离得到的造血干/祖细胞按 2xl 〇 4 个/m l 的密度种入 24 孔板中，添加基础培养液:I M D M ±咅养基含 10% 胎牛血清。添加 4 种细胞因子:40ng/ml F L 、40ng/ml G M -C S F 、1000U/ml
IL-4、 50U /m l T N F -a 。将细胞置于 3 7 ℃ 、体积分数为 5 % C 0 2 的空气条件下培养 2 周。
(2) 每 2 天添加各种细胞因子一次，并取样品对有核细胞进行计数，利用台盼蓝染色计算出活细胞的比率。
⑶ 检 测 。
a. 细胞表面标志分析：
i. 收获诱导前后的细胞，用 P B S 洗涤。
ii.向细胞悬液中分别加入 PE-C D l a 、 FITC-C D 80(B 7-1) 及 PE-H L A - D R 鼠抗人单克隆抗体，以添加 PE-IgGl 及 FITC-IgGl 抗体的细胞作为阴性对照， 4℃ 孵 育 20〜 25 min。
iii. P B S 洗 涤 3 次 ，重新悬浮，用流式细胞仪检测。
b. 同种异体 T 淋巴细胞增殖反应：
i. 取 健 康 志愿者的外周血 10m l ，经淋巴细胞分离液密度梯度离心后收集单个核细胞 (具体步骤参考本节第一部分)。
ii.将获得的 M N C 置 37T 、 5 % 0 ) 2 的培养箱中培养 2h。
iii. 去除贴壁细胞，非 贴 壁 细 胞 用 含 5 % 胎 牛 血 清 的 R P M I 1640 悬 浮 ，注 入 T细胞尼龙毛柱中， 3 7 ℃ 孵 育 lh
iv冲洗出非黏附细胞，用作同种异体 T 细胞，调整密度种人 9 6 孔板中 (IxlO5 个/孔)。
V. 将 诱 导 I4 天的树突细胞与 3 〇 ng/m l 丝裂霉素 C 共 孵 育 30 min。
vi.P B S 缓冲液洗 3 次 。
vii。用含 10% 胎牛血清的 R P M I 1640 培养液悬浮诱导分化的树突细胞，调整密度后，加人预先种有 T 淋巴细胞 (IxlO5 个/孔 ) 的 9 6 孔板中，使效靶比分别 为 1:1000, 1:100, 1 : 1 0 , 均 设 3 个复孔，终 体 积 为 200ul/孔 。
viii. 置 37℃、 5%C0 2 的培养箱中共培养 96h。
ix. 于培养结束前 16 h 加入 0.5 uCi/孔 (ICi = 3.7xl〇10 Bq) 的 [3 H]-TdR。
x. 收集细胞，液闪计数仪检测 c p m 值 ，结 果 用 3 孔均值表示。
(4) 结 果 ： D C 表 达 C Dla 抗原。本室 的 研 究 结 果 表 明 在 F L 、 G M -C S F 、T N F -Ot 及 IL-4 等细胞因子的诱导下，脐
血 C D 3 4+ 细 胞 可 分 化 形 成 大 量 的DC(CDla
+ )。 诱 导 培 养 2 周 后 ，可使CDla+ 细胞的比例增至 (27.18 土 1.56) % ，且培养细胞中可见大量的 D C (图 4.5)，其 中 GM-CSF 和 TNF-a 及 IL-4 是诱导生成 D C 的基本的细胞因子，SC F 和 F L 对诱 导 C D 3 4 + 细胞生成 D C 具有明显的协同 作 用 。 扩 增 后 的 细 胞 中 CDla+ 、C D 8 〇+ (B 7-l) 及 H L A -D R + 细胞的比例分别由扩增前的 (〇.65±0.38)%、（0.36±0.25)% 及 (2.39 土 0.27)% 增加至诱导分化后的(27.18±1.56)%、（22.2±2.23)% 及 (87.68±3.81)%。诱导分化的树突细胞对刺激同种异体 T细胞增殖具有很强的功能。
间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养 与 扩 增
研究表明，除骨髓外，在外周血、脐血、脂肪、关节滑膜以及骨骼肌和皮肤的结缔组织等多种组织中均发现有 M S C 的存在。骨 髓 中 M S C 的含量很低，一 般 为 0.001%〜0.01%，要 利 用 M S C 就必须实现其在体外的分离培养及扩增。目前，分离培养方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。下面分别介绍几种适用于不同来源的人的 M S C 的分离纯化及扩增方法。
骨 髓 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养 1.材料与试剂
骨髓、低糖 D M E M (D M E M -L G ) 、 Percoll 分离液、 IOxPBS、 IxPBS、 MesenCult™培养液、肝素。
2.方法
(1) 无菌条件下采集健康志愿者骨髓，肝素抗凝。
(2) 用 含 10% 胎 牛血清的 D M E M - L G 培养液适当稀释样品， 1500r/min离 心 5 min,弃上清及脂肪层。
(3) 加 入 5m l 含 10% 胎牛血清的 D M E M - L G 培养液，混匀。
⑷ 按 照 I :1 的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为 l. 〇 73 g/m l 的 Percoll分离液中 ， 1500r/m i n 离 心 30 min。离心后管内容物分为 3 层 。上层为血小板，中间层为 Perc0Il分离液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色云雾状的单个核细胞层。
1.073 g/ml Percoll 分离液配制方法： 5.4 ml Percoll 原液、 6m ll 〇 xPBS。 二者混匀后，吸 弃 3 0 0 ul混合液。然 后 用 IxPBS 补 齐 至 l 〇 m l， 即 为 1.073 g/ml Percoll分离液。
(5) 吸取云雾状单个核细胞层，加人培养液稀释混匀，离心洗涤 2 遍 。
(6) 用 MesenCult™ 培养液叹 6111 〇 611(：〇.) 重悬细胞，以 2.(^105 个/〇 112 的细胞密度接种于培养瓶中，置 于 3 7 1 、 5 % CO2、饱和湿度的孵箱内培养。
(7) 48 h 后弃掉未贴壁细胞，更换新鲜培养液。
(8) 以后每 3 天换液一次。
(9) 细胞长到 8 0 % 融合时，用 0.25% 的胰蛋白酶消化。
(10) 按 8xl 〇3 个/cm2 的细胞密度传代进行扩增培养。
3.结果
用 Percoll液 (l. 〇 73 g/ml) 梯度离心从骨髓中分离单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中， 72 h 后出现散在的纺锤状贴壁细胞， 1 〇 〜 1 4 天后形成克隆， M S C 贴壁稀疏时，长梭形细胞的两极朝向不规律，细胞排列混乱，细胞之间往往通过突起相连接。约 3 周出现致密的贴壁细胞层，此时细胞的两极开始有规律地排列成束状 (图 4.6)，有的呈漩涡状 。每瓶单层融合的 M S C 用胰蛋白酶消化后平均获得 (5.5±0.17) XlO5 个细胞，将这些细胞再传代培养，扩 增 I2 代后可获得 2.3xl 〇 9 个细胞，扩增约 4.6xl 〇 4 倍 。
4.注意事项
(1) 在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的 M S C 外 ，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的 M S C ，必须除去其他细胞。根据这些污染细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去; 对于贴壁细胞，可根据其黏附能力与 M S C 黏附能力的不同，通过调整胰蛋白酶-EDTA的消化时间，保 证 M S C 在短暂的时间内与培养皿底分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养皿底，从 而 使 M S C 得到纯化。
⑵选择合适贴壁时间的细胞。如果选用贴壁时间过早的细胞 (1〜 3 h)，则因贴壁细胞数量太少，使细胞生长困难；如果选用贴壁时间过长的细胞 (超过48 h)，在倒置显微镜下可见大量造血细胞黏附在贴壁细胞上呈集落生长，随着培养时间的延长，会出现贴壁细胞形态多样性，细胞传代周期延长，细胞易老化等现象。
(3) 筛选最适于 M S C 生长的血清。首先血清的质量对于 M S C 的生长非常重要，一定要对不同批次的血清进行比较，筛 选 出 最 适 合 M S C 生长的一个批次。本实验介绍的MesenCult™ 培养細卩是选用了经过筛选的适于M S C 增殖的胎牛血清而配制的，通过传代 培 养 后 M S C 的纯度可高达 9 5 % 以上 (一代和二代扩增培养后的 M S C 的表型一致性分
别 达 到 9 5 % 和 98%)。其次，血清的浓度也很重要，并非浓度越高越好，反而高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，易引起细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一 般 以 5 % 〜 10% 胎牛血清最适合 M S C 生长。
(4) 选择合适的接种密度。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一’般适宜密度为 (4——8)xl 〇 4 个/ml(艾国平等 2001)。
脐 带 血 来 源 的 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养脐血干细胞由于取材方便、来源广泛而备受关注。研究表明，来源于胳带血的单个核细胞培养后出现的贴壁细胞有两种表型，破骨样细胞和间充质样细胞 (Lingling et al.2003)。破骨样细胞多核，表 达 T R A P 、 C D 45、 C D 51/C D 6 1 ; 间充质样细胞呈成纤维样，表达 S H 2 、 S H 3 、 S H 4 、 A S M A 、 M A B 1470、 C D 13、 C D 29、 CD49e ，这与骨髓 M S C 完全一致。以下就将脐带血 M S C 的体外分离、纯化、扩增方法做一介绍，为脐带血 M S C的临床应用提供更充足的理论依据和技术方法。
1.材料与试剂
肝素、脐血、 D M E M - L G 、 Ficoll-Hypaque 分离液、甲基纤维素、 IxPBS、 MesenCult™培养液。
2.操作步骤
(1) 无菌条件下采集肝素抗凝的正常人脐血 50——100 ml。
⑵ 与 0.01mol/L p H 7.4 的 PBS 按 I : 1 混匀。
⑶ 再 按 4 : 1 的比例与0.5% 的甲基纤维素混勻，室温静置 30m i n 以沉降红细胞。
(4) 小心吸取上清，离心。
(5) 弃上清，用 P B S 重悬细胞。
(6) 叠加到密度为 1.077 g/ml 的 Ficoll-Hypaque 溶液上， 900 g 离心 20 min。
(7) 取界面层，加 入 P B S 混勻，离心洗涤。
(8) 用 MesenCult™ 培养液 (Stem Cell C o .) 重悬细胞，以 I. OxIO6 个/c m 2 的密度接种于培养瓶中，置 于 37℃ 、 C 0 25 % 、饱和湿度的孵箱内培养。
(9) 1 周后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞。
(10) 以后每 3 天 换 液 1 次。
(II) 细胞长到 8 0 % 融合时用 0.25% 的胰蛋白酶和 0.02% E D T A 混合液消化传代，在显微镜下控制消 i 七时间。
(12) 以 8. 〇 xl 〇3个/c m 2 的细胞密度接种于传代培养瓶中以扩增培养。
3.结果
以 Ficoll-Hypaque液梯度离心分离胳带血单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中 ， 一 周后全量换液，去除未贴壁细胞。有的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞 ，有的脐带血样单个核细胞培养后出现间充质样细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，内含多个核 (图4.7A)。间充质样细胞即为 MSC，胞体呈梭形，最初散在存在，两周后形成包含有几十到几百个细胞的克隆，随着细胞的迅速增殖， 3 周后细胞生长达 80%——90%融合，每个克隆约包含几百至几千个细胞，此 时 的 M SC 呈较均一的长梭形，形态类似于 骨 髓 MSC，但较骨髓 M SC 稍小 (图 4.7B )。 据统计， 6.6xl 〇 5 个脐带血原代 M SC 在体
外 扩 增 10 代后可获得 9.9xl 〇 8 个细胞，扩 增 约 i.5xl 〇3 倍 。
4.注意事项
(1) 当前用于实验和临床的种子细胞主要为来源于骨髓的 MSC，但其数量随着年龄的增长而明显下降。脐血源性 M SC 的优势在于：脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单；对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受；脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低；由于脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应；脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力；不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论 ；收集的脐血不仅可作为异基因移植的供体，而且还可将其低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。
⑵ 与 骨 髓 M SC 相比，目前脐血来源的 MSC 仍存在数量少、频度低等问题。据统计 约 有 1/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现 MSC， 3/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞。因此，在体外培养过程中，如何消除破骨样细胞的存在，如何更好的对其进行纯化扩增，以获得稳定、均一 的 MSC 仍是今后需努力探索的方向。
脂 肪 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养近年来研究发现，脂肪组织中含有能分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的前体细胞 群 ，具有较强的增殖能力和多分化潜能，可称之为脂肪基质细胞或脂肪间充质干细胞(Patricia et al.2001)。
1.材料与试剂
手术器械 (大剪 1 把 、止 血 榭 2 把 、镊 子 2 把 、眼科镊子 1 把 、眼 科 剪 1 把)，筛网 (80目、 2 0 0 目、 4 0 0 目)，平 皿 2 个 ， 50m l 离 心 管 2 个 ， IOml 离 心 管 2 个 。DMEM-LG，PBS，双 抗 ，10% FBS,2% BSA，0.1% 胶原酶，红细胞裂解液 (0.154 mol/LNH4OU 10 mmol/L • KHCO3、 O.lmmol/LEDTA)。
2.方法
⑴将切取的人的脂肪组织放入平皿中，游离血管，用 P B S 冲洗，剪 碎 ，加 入 4 倍体积胶原酶、 1 倍 体 积 B S A 和双抗。
(2) 置 入 50m l 离心管， 37°C 消 化 45 min，并不时摇动。
(3) 将消化成糊状组织的脂肪组织先用 8 0 目筛网过滤，后 用 2 0 0 目再过滤一遍，余下的脂肪组织加入胶原酶继续消化，重复上述操作。
(4) 过 滤 液 8 〇〇 g 离 心 IOmin，去除上清，加入少许含血清培养液，用吸管轻轻吹打，使之成悬液。
(5) 加 入 红 细 胞 裂 解 液 ，室 温 放 置IOmin
(6) 1200r/min 离心 5m i n ， PBS 洗漆2 遍 。
(7) 用 D M E M = L G 培养液 (含 10% F B S ，100U /m l 青霉素， lOOpg/m l 链霉素湩悬细胞 ，接种于培养瓶中，置 于 37℃、 5 % C 0 2、饱和湿度孵箱中培养。
(8) 24 h 后更换培养液。
3.结果
体外培养的脂肪来源的 M S C 易扩增，并呈现成纤维细胞样形态，这与骨髓来源的 MSC—致 (图 4.8)。
4.2.1.4 M A P C 的 分 离 培 养 2 0 0 2 年 ， J i a n g 等从骨髓中分离纯化了一种更为原始的干细胞，称为多能成体祖细(multipotent adult progenitor cell, M APC)(Yuehua et al. 200 2 ，Yukari et al. 2003)。 研究表 明 ， M A P C 具有胚胎干细胞的某些特征，不仅可在体内、外分化成包括 3 个胚层来源的几乎所有组织的细胞，而且具有极强的增殖能力, 体外培养扩增后至少可传 3 0 代以上。
其表面标志为： CD13+ 、 CD44- 、 CD45
- 、 c - k i t - F lk -1 dim 和 M H C -IIclass - 。
1.材料与试剂
⑴ M A C S 磁珠分选系统。
⑵ 扩 增 培 养 基 组 成 ： 60%DMEM-LG; 40%MCDB-201; Ix 胰岛素-转铁蛋白-砸；Ix 油酸-牛血清白蛋白； 10-8 m0I/L 地塞米松； 10-4 moI/L 抗 坏 血 酸 2-磷酸 盐 ； lOng/mlPDGF-BB; I0ng/mlEGF; 2% 胎牛血清。
2.方法
(1) 取健康人骨髓，用 l. 〇77 g/ml 的 Ficoll-Hypaqiie 分离液分离获得单个核细胞。
⑵ 以 Ix lO 5 个/cm 2 的密度接种于纤维结合素包被的培养皿底部，加入上述扩增培养基。
(3) 24 h 后 ，去除未贴壁细胞。
⑷ 细 胞 长 到 8 0 % 融合后，以 5x IO3 个/c m 2 的密度进行扩增培养。
(5) 继续培养 2〜 3 周。
(6) 收获细胞，利 用 M A C S 磁珠分选去 除 CD45+ /GlyA+ 阳性细胞。
(7) 然后将洗脱的细胞以 1 0 个/孔的密度接种于纤维结合素包被的 9 6 孔板中培 养 ，细胞密度维持在 (0.5〜 1.5)x l 03 个/
c m 2。
3.结果检测
人骨髓来源的 M A P C 形态呈多角形 (图 4.9)，细胞胞质少，胞核周围有颗粒其倍增时间为 48——60 h 。
4.注意事项
(1) M A P C 培养与培养条件、细胞密度、 C O 2 浓度、培养 基 p H 、胎牛血清及培养皿的类型等均有关。
(2) 由于高密度下 M A P C 易分化，因此不同种属来源的 M A P C 的细胞种植密度不同 ：小 鼠 和 大 鼠 M A P C 最 适 密 度 为 500——1000 个 /c m 2 , 人 M A P C 最 适 密 度 为 1500〜 3000个/c m 2。
间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养 与 扩 增
研究表明，除骨髓外，在外周血、脐血、脂肪、关节滑膜以及骨骼肌和皮肤的结缔组织等多种组织中均发现有 M S C 的存在。骨 髓 中 M S C 的含量很低，一 般 为 0.001%〜0.01%，要 利 用 M S C 就必须实现其在体外的分离培养及扩增。目前，分离培养方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。下面分别介绍几种适用于不同来源的人的 M S C 的分离纯化及扩增方法。
骨 髓 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养 1.材料与试剂
骨髓、低糖 D M E M (D M E M -L G ) 、 Percoll 分离液、 IOxPBS、 IxPBS、 MesenCult™培养液、肝素。
2.方法
(1) 无菌条件下采集健康志愿者骨髓，肝素抗凝。
(2) 用 含 10% 胎 牛血清的 D M E M - L G 培养液适当稀释样品， 1500r/min离 心 5 min,弃上清及脂肪层。
(3) 加 入 5m l 含 10% 胎牛血清的 D M E M - L G 培养液，混匀。
⑷ 按 照 I :1 的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为 l. 〇 73 g/m l 的 Percoll分离液中 ， 1500r/m i n 离 心 30 min。离心后管内容物分为 3 层 。上层为血小板，中间层为 Perc0Il分离液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色云雾状的单个核细胞层。
1.073 g/ml Percoll 分离液配制方法： 5.4 ml Percoll 原液、 6m ll 〇 xPBS。 二者混匀后，吸 弃 3 0 0 ul混合液。然 后 用 IxPBS 补 齐 至 l 〇 m l， 即 为 1.073 g/ml Percoll分离液。
(5) 吸取云雾状单个核细胞层，加人培养液稀释混匀，离心洗涤 2 遍 。
(6) 用 MesenCult™ 培养液叹 6111 〇 611(：〇.) 重悬细胞，以 2.(^105 个/〇 112 的细胞密度接种于培养瓶中，置 于 3 7 1 、 5 % CO2、饱和湿度的孵箱内培养。
(7) 48 h 后弃掉未贴壁细胞，更换新鲜培养液。
(8) 以后每 3 天换液一次。
(9) 细胞长到 8 0 % 融合时，用 0.25% 的胰蛋白酶消化。
(10) 按 8xl 〇3 个/cm2 的细胞密度传代进行扩增培养。
3.结果
用 Percoll液 (l. 〇 73 g/ml) 梯度离心从骨髓中分离单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中， 72 h 后出现散在的纺锤状贴壁细胞， 1 〇 〜 1 4 天后形成克隆， M S C 贴壁稀疏时，长梭形细胞的两极朝向不规律，细胞排列混乱，细胞之间往往通过突起相连接。约 3 周出现致密的贴壁细胞层，此时细胞的两极开始有规律地排列成束状 (图 4.6)，有的呈漩涡状 。每瓶单层融合的 M S C 用胰蛋白酶消化后平均获得 (5.5±0.17) XlO5 个细胞，将这些细胞再传代培养，扩 增 I2 代后可获得 2.3xl 〇 9 个细胞，扩增约 4.6xl 〇 4 倍 。
4.注意事项
(1) 在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的 M S C 外 ，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的 M S C ，必须除去其他细胞。根据这些污染细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去; 对于贴壁细胞，可根据其黏附能力与 M S C 黏附能力的不同，通过调整胰蛋白酶-EDTA的消化时间，保 证 M S C 在短暂的时间内与培养皿底分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养皿底，从 而 使 M S C 得到纯化。
⑵选择合适贴壁时间的细胞。如果选用贴壁时间过早的细胞 (1〜 3 h)，则因贴壁细胞数量太少，使细胞生长困难；如果选用贴壁时间过长的细胞 (超过48 h)，在倒置显微镜下可见大量造血细胞黏附在贴壁细胞上呈集落生长，随着培养时间的延长，会出现贴壁细胞形态多样性，细胞传代周期延长，细胞易老化等现象。
(3) 筛选最适于 M S C 生长的血清。首先血清的质量对于 M S C 的生长非常重要，一定要对不同批次的血清进行比较，筛 选 出 最 适 合 M S C 生长的一个批次。本实验介绍的MesenCult™ 培养細卩是选用了经过筛选的适于M S C 增殖的胎牛血清而配制的，通过传代 培 养 后 M S C 的纯度可高达 9 5 % 以上 (一代和二代扩增培养后的 M S C 的表型一致性分
别 达 到 9 5 % 和 98%)。其次，血清的浓度也很重要，并非浓度越高越好，反而高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，易引起细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一 般 以 5 % 〜 10% 胎牛血清最适合 M S C 生长。
(4) 选择合适的接种密度。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一’般适宜密度为 (4——8)xl 〇 4 个/ml(艾国平等 2001)。
脐 带 血 来 源 的 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养脐血干细胞由于取材方便、来源广泛而备受关注。研究表明，来源于胳带血的单个核细胞培养后出现的贴壁细胞有两种表型，破骨样细胞和间充质样细胞 (Lingling et al.2003)。破骨样细胞多核，表 达 T R A P 、 C D 45、 C D 51/C D 6 1 ; 间充质样细胞呈成纤维样，表达 S H 2 、 S H 3 、 S H 4 、 A S M A 、 M A B 1470、 C D 13、 C D 29、 CD49e ，这与骨髓 M S C 完全一致。以下就将脐带血 M S C 的体外分离、纯化、扩增方法做一介绍，为脐带血 M S C的临床应用提供更充足的理论依据和技术方法。
1.材料与试剂
肝素、脐血、 D M E M - L G 、 Ficoll-Hypaque 分离液、甲基纤维素、 IxPBS、 MesenCult™培养液。
2.操作步骤
(1) 无菌条件下采集肝素抗凝的正常人脐血 50——100 ml。
⑵ 与 0.01mol/L p H 7.4 的 PBS 按 I : 1 混匀。
⑶ 再 按 4 : 1 的比例与0.5% 的甲基纤维素混勻，室温静置 30m i n 以沉降红细胞。
(4) 小心吸取上清，离心。
(5) 弃上清，用 P B S 重悬细胞。
(6) 叠加到密度为 1.077 g/ml 的 Ficoll-Hypaque 溶液上， 900 g 离心 20 min。
(7) 取界面层，加 入 P B S 混勻，离心洗涤。
(8) 用 MesenCult™ 培养液 (Stem Cell C o .) 重悬细胞，以 I. OxIO6 个/c m 2 的密度接种于培养瓶中，置 于 37℃ 、 C 0 25 % 、饱和湿度的孵箱内培养。
(9) 1 周后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞。
(10) 以后每 3 天 换 液 1 次。
(II) 细胞长到 8 0 % 融合时用 0.25% 的胰蛋白酶和 0.02% E D T A 混合液消化传代，在显微镜下控制消 i 七时间。
(12) 以 8. 〇 xl 〇3个/c m 2 的细胞密度接种于传代培养瓶中以扩增培养。
3.结果
以 Ficoll-Hypaque液梯度离心分离胳带血单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中 ， 一 周后全量换液，去除未贴壁细胞。有的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞 ，有的脐带血样单个核细胞培养后出现间充质样细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，内含多个核 (图4.7A)。间充质样细胞即为 MSC，胞体呈梭形，最初散在存在，两周后形成包含有几十到几百个细胞的克隆，随着细胞的迅速增殖， 3 周后细胞生长达 80%——90%融合，每个克隆约包含几百至几千个细胞，此 时 的 M SC 呈较均一的长梭形，形态类似于 骨 髓 MSC，但较骨髓 M SC 稍小 (图 4.7B )。 据统计， 6.6xl 〇 5 个脐带血原代 M SC 在体
外 扩 增 10 代后可获得 9.9xl 〇 8 个细胞，扩 增 约 i.5xl 〇3 倍 。
4.注意事项
(1) 当前用于实验和临床的种子细胞主要为来源于骨髓的 MSC，但其数量随着年龄的增长而明显下降。脐血源性 M SC 的优势在于：脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单；对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受；脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低；由于脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应；脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力；不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论 ；收集的脐血不仅可作为异基因移植的供体，而且还可将其低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。
⑵ 与 骨 髓 M SC 相比，目前脐血来源的 MSC 仍存在数量少、频度低等问题。据统计 约 有 1/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现 MSC， 3/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞。因此，在体外培养过程中，如何消除破骨样细胞的存在，如何更好的对其进行纯化扩增，以获得稳定、均一 的 MSC 仍是今后需努力探索的方向。
脂 肪 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养近年来研究发现，脂肪组织中含有能分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的前体细胞 群 ，具有较强的增殖能力和多分化潜能，可称之为脂肪基质细胞或脂肪间充质干细胞(Patricia et al.2001)。
1.材料与试剂
手术器械 (大剪 1 把 、止 血 榭 2 把 、镊 子 2 把 、眼科镊子 1 把 、眼 科 剪 1 把)，筛网 (80目、 2 0 0 目、 4 0 0 目)，平 皿 2 个 ， 50m l 离 心 管 2 个 ， IOml 离 心 管 2 个 。DMEM-LG，PBS，双 抗 ，10% FBS,2% BSA，0.1% 胶原酶，红细胞裂解液 (0.154 mol/LNH4OU 10 mmol/L • KHCO3、 O.lmmol/LEDTA)。
2.方法
⑴将切取的人的脂肪组织放入平皿中，游离血管，用 P B S 冲洗，剪 碎 ，加 入 4 倍体积胶原酶、 1 倍 体 积 B S A 和双抗。
(2) 置 入 50m l 离心管， 37°C 消 化 45 min，并不时摇动。
(3) 将消化成糊状组织的脂肪组织先用 8 0 目筛网过滤，后 用 2 0 0 目再过滤一遍，余下的脂肪组织加入胶原酶继续消化，重复上述操作。
(4) 过 滤 液 8 〇〇 g 离 心 IOmin，去除上清，加入少许含血清培养液，用吸管轻轻吹打，使之成悬液。
(5) 加 入 红 细 胞 裂 解 液 ，室 温 放 置IOmin
(6) 1200r/min 离心 5m i n ， PBS 洗漆2 遍 。
(7) 用 D M E M = L G 培养液 (含 10% F B S ，100U /m l 青霉素， lOOpg/m l 链霉素湩悬细胞 ，接种于培养瓶中，置 于 37℃、 5 % C 0 2、饱和湿度孵箱中培养。
(8) 24 h 后更换培养液。
3.结果
体外培养的脂肪来源的 M S C 易扩增，并呈现成纤维细胞样形态，这与骨髓来源的 MSC—致 (图 4.8)。
4.2.1.4 M A P C 的 分 离 培 养 2 0 0 2 年 ， J i a n g 等从骨髓中分离纯化了一种更为原始的干细胞，称为多能成体祖细(multipotent adult progenitor cell, M APC)(Yuehua et al. 200 2 ，Yukari et al. 2003)。 研究表 明 ， M A P C 具有胚胎干细胞的某些特征，不仅可在体内、外分化成包括 3 个胚层来源的几乎所有组织的细胞，而且具有极强的增殖能力, 体外培养扩增后至少可传 3 0 代以上。
其表面标志为： CD13+ 、 CD44- 、 CD45
- 、 c - k i t - F lk -1 dim 和 M H C -IIclass - 。
1.材料与试剂
⑴ M A C S 磁珠分选系统。
⑵ 扩 增 培 养 基 组 成 ： 60%DMEM-LG; 40%MCDB-201; Ix 胰岛素-转铁蛋白-砸；Ix 油酸-牛血清白蛋白； 10-8 m0I/L 地塞米松； 10-4 moI/L 抗 坏 血 酸 2-磷酸 盐 ； lOng/mlPDGF-BB; I0ng/mlEGF; 2% 胎牛血清。
2.方法
(1) 取健康人骨髓，用 l. 〇77 g/ml 的 Ficoll-Hypaqiie 分离液分离获得单个核细胞。
⑵ 以 Ix lO 5 个/cm 2 的密度接种于纤维结合素包被的培养皿底部，加入上述扩增培养基。
(3) 24 h 后 ，去除未贴壁细胞。
⑷ 细 胞 长 到 8 0 % 融合后，以 5x IO3 个/c m 2 的密度进行扩增培养。
(5) 继续培养 2〜 3 周。
(6) 收获细胞，利 用 M A C S 磁珠分选去 除 CD45+ /GlyA+ 阳性细胞。
(7) 然后将洗脱的细胞以 1 0 个/孔的密度接种于纤维结合素包被的 9 6 孔板中培 养 ，细胞密度维持在 (0.5〜 1.5)x l 03 个/
c m 2。
3.结果检测
人骨髓来源的 M A P C 形态呈多角形 (图 4.9)，细胞胞质少，胞核周围有颗粒其倍增时间为 48——60 h 。
4.注意事项
(1) M A P C 培养与培养条件、细胞密度、 C O 2 浓度、培养 基 p H 、胎牛血清及培养皿的类型等均有关。
(2) 由于高密度下 M A P C 易分化，因此不同种属来源的 M A P C 的细胞种植密度不同 ：小 鼠 和 大 鼠 M A P C 最 适 密 度 为 500——1000 个 /c m 2 , 人 M A P C 最 适 密 度 为 1500〜 3000个/c m 2。
M SC 的 鉴 定与 H S C 不同， M S C 具有多种标志，具有非单一性的特点。因此目前对 M S C 主要是通过将其形态学特征、多种表面标志及其具有的向骨、软骨、脂肪及神经等多种方向的分化功能这多方面相结合来进行鉴定的。
形 态 学 鉴 定见本节间充质干细胞的分离培养与扩增结果检测部分。
表 型 鉴 定由于各个研究小组在标本的来源、分离的方法、检测细胞的代次以及培养条件等方面存在差异，因而检测到的 M S C 标志物之间也存在较大差异。但多数研究显示，M S C 是一群均质细胞，不表达造血细胞、成纤维细胞及内皮细胞抗原。
1.方法
⑴ 取 传 代 扩 增 后 的 M S C ，用 0.25% 的胰蛋白酶消化。
⑵ 收 获 1.5xl06 个 M S C 细胞，分 成 每 个 E p 管 (1.5 ml)5xl 〇 5 个 M S C 细胞，洗漆后
重 悬 于 P B S 。
⑶ 分 别 加 入 抗 C D 29、 C D 34、 C D 44、 C D 45、 C D 92、 C D 166 和 H L A 2D R 单克隆抗 体 ，室温孵育30 min。同时设立阴性对照。
(4) 经 P B S 洗 涤 2 次后与 F I T C 标记的二抗避光反应 15 min。
(5) 细胞洗涤后悬浮于 P B S 中 ，流式细胞仪检测。
2.骨 髓 M SC 的表型特征
用流式细胞仪分析 M S C 的表面抗原，结果显示， M S C 均一地表达 C D 166(间质细胞阳性); 黏附分子 C D 29、C D 44(纤连蛋白和透明质酸盐的受体、基质细胞阳性); 而 CD34(造血干/祖细胞及内皮细胞阳性)、 C D 45(白细胞阳性)、 H L A 2D R (抗原呈递细胞及激活 T 细胞阳性) 及荆豆素 (内皮细胞的标记) 阴性。
3.注意事项
由于间充质干细胞的分化可能是随机非方向性的，因此已经分化的间充质干细胞依然具有转化生成其他类型间充质细胞的潜能。再 者 ，个体不同发育阶段的间充质干细胞的表型功能特异性方面存在差异，上述可能是造成对间充质干细胞细胞表型特征存在争议的原因。因此，到目前为止，对 于 M S C 鉴别并没有特异的分子标记，在这些方面还有待于进一步深入研究。
4 . 2 . 2 . 3 功 能 鉴 定
在体外特定的诱导条件下， M S C 可以分化为骨 (A K P 、钙沉积或骨桥蛋白染色)、软骨 (II 型胶原、酸性蛋白聚糖染色)、脂肪 (亲脂性染料 Nile red 或 Oil red 染色)、肌腱、肌肉、神经、基质、肝和内皮等多种细胞。而 形 态 与 M S C 相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。因此我们可根据 M S C 特有的分化潜能对其进行鉴定。具体过程见下述 M S C 的诱导分化。
骨 髓 M S C 除了参与构成造血微环境，还具有广泛的分化潜能。大量的体内外实验证 明 ， M S C 不仅可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等间质组织外，还可跨越胚层界限，分化为外胚层的神经细胞及内胚层的肝脏细胞等。
M S C 向 骨 细 胞 的 诱 导 分 化 1.材料与试剂
D M E M -L G 、F B S 、10-7 mol/L 地塞米松、10mmol /L β-甘油磷酸钠和 50ug/ml 维生素 C 。
2.诱导步骤
(1) 取 传 代 M S C ，用胰酶消化成单细胞悬液。
(2) 以 8.0xl03 个/c m 2 细胞浓度接种于预先置有盖玻片的 6 孔板内以制备细胞爬片。
(3) 每孔加入 D M E M -L G 培养液，置培养箱中，隔天换液 1 次
(4) 待细胞融合达8 0 % ，吸去孔内培养液。
(5)实验组每孔加人成骨细胞诱导液(含l( 10-7 mol/L 地塞米松、 10mmol/L β-甘油磷酸钠 和 5〇 ug/m l维 生 素 C )2m l ，对照组每孔加入等量DMEM-LG培养液，置培养箱中。
(6) 每 3 ~ 4 天 换 液 1 次
3) Von Kossa 检测沉积
在骨诱导培养的第 2 1 天 ，用 Von Kossa 方法可检测到钙沉积的情况。镜下观察到Von Kossa 强阳性为较大的黑色结节，成骨细胞因包埋在钙化基质中而见不到清晰的细胞轮廓。
4 ) 免疫组化检测 I 型胶原表达情况
骨诱导培养 2 1 天 ，免疫组化 S P 法可检测到 I 型胶原表达，在结节周围呈黄褐色。
注意事项
M S C 的分化能力会随扩增代数的增高而降低，因而应尽量使用代数较早的细胞。
M S C 向 软 骨 细 胞 的 诱 导 分 化 1.材料与试剂
髙 糖 D M E M 、 F B S 、 6.25|Lig/m l 胰岛素、 6.25pg/m l 转铁蛋白、 1.25|ng/m l 牛血清白蛋白、lmmol/L 丙酮酸钠、5.35ug/ml 亚油酸、50pg/ml 维生素 C 、10_7mol/L 地塞米松、l 〇 ng/ml
T G F -β 、爱茜蓝 (alcianblue)、 II 型胶原单克隆抗体。
2.诱导步骤
(1) 取 扩 增 M S C 以 1.5xl 〇8 个/L 的细胞密度接种于预先放置有消毒处理好的盖玻片的 6 孔板内。
(2) 细胞贴壁后更换培养液。特定的无血清软骨培养液的组成成分为：高 糖 D M E M ，胰岛素 (6.25ug/ml)，转铁蛋白 (6.25ug/ml)，牛血清白蛋白 (1.25ug/ml ，丙酮酸钠 (Immol/L)，亚油酸 (5.35ug/ml)，维生素 C (50ug/ml)，地塞米松 (l 〇-7 mol/L )。
(3) 转 移 Iml细胞悬液于 15m l 塑料锥形离心管内， 500r/m i n 低 速 离 心 15 min，使细胞形成微团。
(4)叫加入 l 〇 ng/mlT G F -β ，置 于 3 7 ℃ 、 5 % CO2的孵箱内培养。
(5) 每 2——3 天用上述培养基加新鲜的 T G F -β 换液。
3.软骨细胞的鉴定
(1) 爱茜蓝染色：
a. 聚集诱导软骨培养 18、 2 1 天的细胞团经冰冻切片机切成厚度为5um 的切片
b. 甲醇 4 ¾ 固 定 lOmin。
c. 室温下切片用去离子水洗 3 次 ，每 次 2 min。
d. 浸 于 10% 爱茜蓝中室温过夜。
e. P B S 缓冲液洗 3 次后镜下观察细胞形态。
(2) II 型胶原测定：一 抗 为 II 型胶原单克隆抗体。检测步骤与骨细胞的鉴别中 I 型胶原的测定相同。
4.结果检测
在细胞聚集培养 24 h 后 ，加入地塞米松及 T G F -β 的细胞团与管壁分离，并可在试管中持续生长长达 3 〇天。培 养 第 1 8 天 ，切片经爱茜蓝染色可观察到蓝染的软骨细胞 (图4.11A )， II 型胶原弱阳性分布于软骨细胞切片的周边。培 养 第 2 1 天 ， II 型胶原呈强阳性
(图 4.11B )
M S C 在 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和消炎痛等诱导下可向脂肪组织分化。分化的细胞可表达过氧化物酶体增殖激活的受体_2(p p a R -2)、脂蛋白脂酶和脂肪酶结合蛋白 aP2 , 且在细胞内出现富集的脂质小泡。在该培养条件下，约 95% 的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞。
1.材料与试剂
高 糖 D M E M 、 F B S 、地 塞 米 松 1umol/L 、胰 岛 素 l〇 m g /L 、 O.5 mmol/L l -甲基-3-异丁基-黄嘌呤、100umol/L 吲哚美辛、2 % 油 红 o(称 取 2 g 油红干粉溶于 IOOml 的 7 0 % 乙醇中，研 磨 ，过滤，室温保存)。
2.诱导步驟
(1) 取体外扩增培养的 M S C ，置于孔板或培养皿中。
(2)当细胞贴壁生长达到8 0 % 融合时，加入脂肪诱导试剂：含 地 塞 米 松 、胰 岛 素 10m g /L ， 0.5 mmol/L l -甲基-3-异丁基-黄嘌呤， l〇〇 umol/L 吲哚美辛，置 于 37℃，5 % C O 2 的孵箱内培养。
⑶ 对 照 组 加 常 规 培 养 液 (D M E M + 10%FBS)
(4) 每 3〜 4 天换液一次。
3.油 红 〇染色
(1) 取 诱 导 培 养 组 和 未 诱 导 培 养 组 的 细甲醇固定 2 min。
⑵ 7 0 % 乙醇漂洗。
(3) 加 入 2 % 油 红 O 染料染色，室 温 5 min。
⑷ 弃 去 染 液 ，7 0 % 乙醇漂洗后, 用水冲洗。
(5) 苏木精复染 lmin。
(6) 镜下观察脂肪细胞形态及染色情况
4.结果
M S C 原代培养成脂诱导 7 天后，细胞胞质内开始出现细小脂滴；诱 导 1 4 天后细胞胞质内形成高折光性的脂滴，脂肪细胞主要集中在克隆中心，提高放大倍数可清晰地观察到胞质内的脂滴；而且随着培养时间的延长，诱导培养 2 1 天 ，脂肪滴逐渐增大可充满整个细胞，当加人油红 O 染液显示胞核呈蓝色，脂滴呈橙红色 (图 4.12)。脂肪细胞平均占 (88±4.6)%。对于对照组进行光镜下观察和油红 O 染色均未见脂滴。
M S C 向 心 肌 细 胞 的 诱 导 分 化5-氮胞苷 (5-azacytidine， 5-aza) 可在体外诱导 M S C 分化为心肌样细胞。研 究表明，5-aza 是一种去甲基化药物，它可以与控制向心肌分化的特异启动子基因上的阻遏蛋白结合 ，使其去甲基化，发生构型改变，从而启动干细胞向心肌的分化。
1.材料与试剂
5-aza、 羊抗肌钙蛋白 I (troponin I， TnI) 多克隆抗体、小鼠抗人结蛋白 (desmin) 单克隆抗体、小 鼠 抗 人 G A T A 4 抗体、羊抗连接蛋白 connexin4 3 抗体、兔 抗 山 羊 IgG-FITC和抗小鼠 IgG-TRITCo
2.诱导步骤
⑴ 取 分 离 培 养 后 3 代 人 M S C 细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化。
(2) 以 2xl05 个/c m 2 的密度接种于 2 4 孔塑料培养板中。
(3) 在完全培养液中加入 3umol/L、 5umol/L 、 lOumol/L 5-aza。
(4) 诱导分化 24 h 后 ，吸弃培养液。
(5) P B S 清 洗 2 次 ，继续用不含诱导剂的完全培养液培养。
(6) 每 2——3 天 换 液 1 次。
(7) 光学显微镜动态观察诱导后不同时间的细胞形态变化。
心肌细胞的鉴定1.细胞免疫荧光检测
⑴ 细 胞 爬 片 用 P B S 洗 涤 2 次 ，每 次 5 min。
⑵ 4 % 多聚甲醛室温固定 b m i n 。
(3) P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。
⑷ 含 0.1% Triton 和 0.3% H 2O 2 的甲醇溶液封闭 lOmin，以消除内源性过氧化物酶。
⑶ 蒸 馏 水 冲 洗 ， P B S 浸 泡 5 min。
(6) 山羊血清工作液室温孵育15 min。
(7) 去血清后分另Ij 加 cTnl(心肌特异性肌钙蛋白 I 特异性抗体) 和单克隆抗体工作液5 〇 ul，置于湿盒中 4℃ 过夜。
(8) P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。
(9) 滴加荧光标记的二抗 (兔抗山羊 IgG-F I T C 和抗小鼠 IgG-TRITC) 工作液， 37℃孵育 30 min。
(10) P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。
(11) 直接在灰光显微镜下观察结果。
2.R T - P C R 检测分化细胞心肌特异因子β-M H C 的表达
分别提取 2、 7、 11 代未诱导的 hMSC(对照) 和 lOumol/L 的 5-aza 诱导后 2 1 天的细胞总R N A ，逆转录后进行 PCR。 AMHC 基因全长 688bp，根据全长设计 PCR 引物：上游5^ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3,下游引物： 5:TCGACAATGTGTCCGAGGTC-3、同时用 GAPDH 作参照。
结果
1 ) 形态学变化
经 5 umol/L 、 l〇umol/L 的 5-aza 进行化学诱导后细胞形态变长，体积增大，诱导后1 4 天 时 2 0 % 的 Siamol/L 浓度组细胞及 3 0 % 的 lOumol/L 浓度组细胞出现细胞融合形成多核肌管样结构；诱 导 后 2 1 天时细胞出现分叉，呈树枝样 (图 4.13)。 3umol/L 浓 度组 h M S C在诱导后细胞形态略长，未出现肌管结构^ 3 组 中 3umol/L 浓 度 组 h M S C 细胞增殖最强，lOumol/L 浓度组细胞发生细胞空泡样变性的比例较大，而且细胞增殖能力下降
2 ) 细胞免疫荧光染色结果
细胞核经 D A P I 衬染后在紫外光激发下呈蓝色荧光。对照组未经诱导的 M s c 胞质内不表达单克隆抗体和 cTnl，细胞不着色；而 诱 导 后 2 3天 ， I 5 、 10umol/L 浓 度 组 hMSC可见单克隆抗体表达阳性 (红色荧光)， C T n I 表达阳性 (绿色荧光)，心肌早期转录因子G A T A 4 染色阳性 (红色荧光)、 连接蛋白 connexin4 3 的表达阳性 (绿色荧光)(图 4.14)。 后 3种蛋白质的阳性染色提示 hMSC 经过诱导后可以向心肌细胞分化，并具有心肌细胞特有的结构蛋白。
分别随机取 5 个高倍视野，进行细胞计数， lOumol/L 组 的 cTnl 阳性染色细胞数目 (65.3±4.7)% 高 于 5umol/L 诱导组 (48.2 土 5.4)% (P 0.05); 3umol/L组MSC cTnI等特异性蛋白阳性染色细胞低于5 % ，阴性对照组各种抗体染色均为阴性。
3) RT-PCR 结果
h M S C 经 5-aza诱 导 后 2 1 天所分化的心肌样细胞经R T -P C R 显示，诱导后细胞在m R N A 水平表达心肌细胞特异肌凝蛋白重链β-M H C ，而未经诱导的M S C 无β-M H C 的表达
注意事项
(1) 经 5-aza诱导后M S C 可以出现肌系细胞的蛋白质表达及心肌特异性基因岸M H Cm R N A 表达，表 明 M S C 具有向肌系细胞分化的能力。由于诱导后的细胞在形态及功能上与成熟的心肌还存在一定差异(如未能观察到诱导细胞的自发搏动)，故 称 为 「心肌样细胞」。
(2) 5-aza诱 导 MSC分化为心肌细胞的效率较低，因此如何提高诱导效率及明确甘分化机制等难题亟待解决。
M S C 向 神 经 细 胞 的 诱 导 分 化1.材料与试剂
3umol/L β-巯基乙醇、 2 % 二甲基亚砜(DMSO)、 200umol/L 丁化羟基苯甲醚(BHA)、鼠抗人的神经丝蛋白 (NF)、神经元特异性烯醇化酿N S E )单克隆抗体和甲苯胺蓝 。
2.操作步骤
(1) 取 体 外 扩 增 的 MSC， 以 8.0x l〇3 个/cm2的细胞密度接种于 6 孔板中，培养条件为 DMEM+10%FBS
⑵ 当 细 胞 达 到 60%〜 70% 融合时，用 3umol/L β- 巯 基 乙 醇 预 诱 导 施 ，培养条件为D M EM +20% F B S
(3) PBS洗涤后，再用2% 的二甲基亚砜(DMSO) 和 200^imol/L 丁化羟基苯甲醚(BHA)进行正式诱导。
(4) 每 隔 30 min观察一次，直至细胞形态无明显变化。
(5)同时采取另一种诱导方法进行诱导，即用同样的方法预诱导后再分另Ij 用 含 1、 3、5 、 7 、 lOumol/L BME 的 DMEM 培养液代替含 2 % DMSO 和 200|amol/L BHA 的 DMEM培养液诱导MSC。
神经细胞的鉴定
1 ) 免疫组织化学染色
分别取诱导2 h 、 4 h、 6 h 、 12 h 后的细胞爬片，参照HistostainTM-SP(链霉卵白素-过氧化物酶)试剂盒操作方法进行免疫组织化学染 色 。 一抗为鼠抗人的神经丝蛋白 (NF) 和神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体，二抗为羊抗鼠 IgG。 阴性对照用0.01mol /L 的 PBS
代 替 NSE和 N F单克隆抗体，实验对照用未诱导的MSC细胞爬片直接进行N F 和 NSE免疫组织化学染色。
另取诱导后4 h 、 6 h 、 8 h 的细胞爬片，用甲苯胺蓝染色，观察尼氏体。染色步骤如下：
⑴ 细 胞 爬 片 用 P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。
(2) 10% 中性福尔马林固定30 min， PBS洗 涤 30 min。
(3) 0.5% 的甲苯胺蓝染色3 min。
(4) 去离子水洗。
(5) 95% 乙醇分色，显微镜下控制分色时间至细胞结构清晰为止。
(6) 100% 乙醇脱水2 次 ，每 次 2 min。
(7) 二甲苯透明lOmin。
(8) 中性树胶封片。
(9) 显微镜下观察结果。
2) MSC向神经细胞诱导后Ak幼Vx基因的检测
提取诱导后细胞的总RNA， 逆 转 录 后 进 行 PCR。 AW如 基 因 全 长 495bp。 根据全
长设计 PCR 弓丨物：上 游 ： 5， -AGAGGGGAATTCCTGGAG-3，； 下 游 ： 5， -CTGAGGACCAGGACTCTCTCT-3、 同时用 GAPDH 作 参 照 。
结果判定
I) MSC向神经细胞转化过程中的形态变化
在 预 诱 导 后 12 h发现原来大而扁平的M SC胞体发生收缩，细胞边缘变的不规整，有许多细的指状突起，（图 4.15)。 预诱导结束时，一部分细胞胞体已变成近似圆形。正式诱导后的3 h 内细胞发生了明显的形态学变化，细胞胞体进一步收缩，形成圆形、不规整的锥形、. 三角形，有的细胞有多个突起，而且发出分支，终末端有类似神经元细胞的终 结 ；有的突起逐渐伸长，形成圆锥状终末端，类 似 于 Golgi I 型神经元的长轴突(图4.15B〜 F)， 5 h 后细胞形态基本不再发生明显变化，有 80% 以上的细胞呈现典型的神经元样表型。
分 别 用 含 1、 3 、 5 、 7 、 10umol/L A 巯基乙醇的 D M E M 培养液诱导M S C ，均可观察到典型的神经细胞，只是转化率较用含2 % D M S O 和 200pmol/L B H A 的 D M E M 培养液诱导时低。
2 ) 免疫组织化学和组织化学染色结果
在 诱 导 M S C 向神经细胞分化过程中，取 诱 导 2 h 、 4 h 、 6 h 、 12 h 后的细胞爬片，检测 N S E 和 N F 的表达情况。观察发现，未诱导的M S C 不表达N S E 和 N F ，细胞不着色(图4.16A、 C )Q 诱导后不同时间的细胞均有N S E 和 N F 表达。阳性细胞呈棕褐色。 N S E 阳性细胞表现为弥漫性胞质着色(图 4.16B); N F 在核周和突起均有表达(图 4.16D)。不同扩增代数的骨髓M S C 向神经细胞分化后均表达N SE 和 NF。 不同代数的MSC分化过程中N S E 和 N F 阳性率 (显微镜下记数100 个细胞中N S E 和 N F 阳性的细胞数，分别随机记数5 次)，经统计学分析无显著性差异(P 〇. 〇 5)
甲苯胺蓝染色发现，诱 导 6 h 和 8 h 后的神经细胞的胞质中存在着深蓝色的块状或颗粒状的尼氏体 (图 4.17)。
3) Nestin 的检测
未诱导的M S C 不表 达 Nestin, 诱 导 5 h 后的细胞表达Nestin，电泳后出现495b p 的特异性片段(图4.18)
神经干细胞
大量研究表明发育和成熟的神经系统内均存在着神经干细胞 (neural s t e m cell，N S C )。发育过程中的胎脑的纹状体、海马、皮层脑室区等多个部分都含有大量的神经干细胞；而在成年哺乳动物体内的多个区域也同样可以分离出神经干细胞，如海马齿状回的颗粒下层、侧脑室的室管膜下区、大脑皮层、小脑和脊髓等。不同来源的神经干细胞的培养扩增的方法大致相同，故我们以胚胎大鼠神经干细胞的分离培养扩增方法为例。但值得注意的是，不同来源的神经干细胞对生长因子的反应性存在差异，所以可以对无血清限
定培养液中的细胞因子种类和浓度进行调整。
大 鼠 胎 脑 和 胚 胎 脊 髓 N S C 的 分 离 、培养
⑴ 仪 器 、材料和试剂：
洁净工作台；二氧化碳培养箱；电子分析天平；电热保温干燥箱；倒置显微镜；焚光显微镜；Milli-Q超纯水制备系统；调温低速离心机；孕鼠；手术器械；75% 乙醇；b F G F ;E G F ; D M E M /F 12(1 : 1) 培养基；胎牛血清； DNaseI; 多聚赖氨酸；胰蛋白酶；神经细胞培养添加剂B 27; D-Hank 缓冲液； P B S 缓冲液。
⑵ 将 怀 孕 13天 的 S-D 鼠用颈椎脱臼法处死，于 7 5 % 乙醇中浸泡消毒lOmin。
(3)无菌条件下剪开孕鼠腹部，取出胎鼠，放入预冷的 D -H a n k 缓冲液中浸洗2 次 。D -Hank: 氯 化 钾 0.4 g/L 、磷酸二氢钾0.06 g/L 、氯 化 钠 8.0 g/L 、碳 酸 氢 钠 0.35 g/L 、磷酸氢二钠 (Na2 H P O 4 • 7 H 20) 0.09 g/L 、酚红 0.02 g/L 。
⑷解剖显微镜下仔细分离胎脑及胚胎脊髓，分离的组织用D -H a n k 缓冲液冲洗后，小心去除表面的脑膜组织。
(5) 将分离的胎脑和胚胎脊髓组织剪成约I m m3 的碎块。
(6) 各 加 Iml P B S 和 Iml 0.25% 的胰蛋白酶，在 5 % C O 2 培养箱中3 7℃ 消 化 20 min。
(7) 加含血清的培养基以终止消化。
(8) 加5uL DNase I (15U /ul) 在 5 % C O 2 培养箱中 3 7 ℃ 消化 lOmin。
(9) 用吸管吹打成单细胞悬液，细胞计数， 1200r/m i n 离 心 5 min，弃上清。
(10) 把 细 胞 按 IxlO6 个/ml 的密度接种入N S C 培养液中，每日在显微镜下观察细胞的生长情况，注意培养基有无混浊和异物。隔日半量换液， 7〜 10天传代一次。
N S C 培养液 ： D M E M /F 12、 b F G F 20ng/ml、 E G F 20ng/mI、 2 % B 27
悬 浮 培 养 的 N S C 的传代
(1)收集培养的神经球，离心 (1200r/min， 5 min)。
⑵ 弃 上 清 ， Iml 的 I x P B S 重悬细胞，加 Iml 0.25% 胰 蛋 白 酶 。
(3) 37℃ 孵 育 IOmin， 将神经球消化成单细胞悬液，加含血清的培养基以终止消化
⑷ 视 N SC的量加入适量的 DNase I 消化细胞碎片， 37℃孵 育 5 min。
⑶ 离 心 ，弃 上 清 ，重悬细胞并计数，按 5x l〇5 〜 IxlO6 个/m l 的 比 例 加 人 N SC 培养 基 。
细 胞 单 克 隆 实 验
(1) 从原代培养形成的细胞克隆中选取单个细胞克隆，0.25% 胰酶消化后用巴氏吸管机械吹打使克隆分散成单个细胞。
⑵ 台 盼 蓝 染 色 计 数 后 ，将 细 胞 稀 释 为 IO2 个/ m l , 取 10^1加 入 到 9 6 孔 板 ，并补入NSC培 养 液 200ul。
(3) 24 h 后标记单细胞孔，继续培养。
⑷ 每 3〜 4 天添加半量N S C 培养液。
(5)单细胞克隆长大后用胰酶消化机械分离成单细胞悬液，将一个克隆的所有细胞种 人 T -25 c m 2 培养瓶中培养(培养基同前)，待次代克隆长成后连续传代。
结 果 分 析
怀 孕 1 3 天胎鼠脑组织和脊髓组织分离培养的原代细胞在无血清培养基中生长少量细胞贴壁，培 养 2 天 后 ，有大量的细胞死亡，存活的细胞呈圆形，折光性强，部分 细 胞 分 裂 形 成 包 含 有 2 —— 4 个细胞的细胞团；第 3——5天 时 ，细胞团内细胞数目迅速增加，出 现 「神经球」样结 构 ：细胞分裂(不完全排除细胞聚集)形成细胞团，呈 悬 浮 状 生 长 ，细胞无明显的突起形成。至 第 7——10天可生长成为由数百个甚至上千个细胞形成的细胞团(图4.19)。传代培养的 N S C 生长迅速，经 1 5 次传代培养图 4 .19 怀 孕 1 3 天 胚 胎 大 鼠 脑 组 织 来 源 的 神 经 球 后 细 胞 数 量 平 均 增 加 2 . 4 5x l 0 4 倍 ，细胞得到大量扩增。
神 经 干 细 胞 的 分 化神 经 干 细 胞 的 自 然 分 化
⑴ 材 料 和 试 剂 ：胎牛血清； D M E M /F 1 2 培养液； 4 % 多聚甲醛；小鼠抗-β微管蛋白(tubulin), 抗-巢蛋白 (nestin)，抗-半乳糖脑苷脂(galactocerebroside, Galc)单克隆抗体；兔抗-GFAP单克隆抗体；各种荧光素标记二抗；免疫组化染色试剂盒； DAB或 AEC显色试剂盒。
(2) 取 传 至 第 3 代 、来源于同一个神经干细胞的亚细胞系克隆球，消化分离克隆制作单细胞悬液，按 IxlO6 个/m l 的比例种于预先放置多聚赖氨酸包被的盖玻片的6 孔培养板 中 ，并加入有血清培养基 (10% 胎牛血清的 D M E M /F 1 2 培养液)，置 37℃ 、 5 % C O 2培养箱中培养 7 —— 1 0 天 。
(3) 观察细胞的自然分化状况、新形成的细胞形态，并用免疫细胞化学技术及细胞免疫荧光技术进行鉴定。原代和第3 代 N S C 神经球或单个细胞进行巢蛋白 (n e stin ， N S 的特异标志蛋白)免疫细胞化学染色，第 3 代 N S C 在分化培养基中自然分化 7 —— 1 0 天后对巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic p rotein , G F A P ， 星形胶质细胞的特异性标 志 蛋 白）、 β-微管蛋白(A tu b u lin ，神 经 元 的 特 异 性 标 志 蛋 白）和 半 乳 糖 脑苷(galactocerebroside， G a l C , 少突胶质细胞的特异性标志蛋白)进行染色， 在随机选取的10
个显微镜视野内对各种阳性细胞进行计数从而计算其比例，鉴 定 N S C 的自然分化能力。
具体步骤如下：
a.标 本 用 4 % 多聚甲醛固定2 0 m in 。
b.4% 多聚甲醛： 40g多聚甲醛溶解于70〇 ml PBS，加 热 到 60℃，不停搅拌，均匀溶 解 后 再 滴 入 lmol/L N a O H 1〜 2 滴至完全澄清，冷 却 后 补 充 P B S 液至总量1000 ml。放 代 冰 箱 备 用 。
c. IxPBS 冲洗， 5 minx3 次 。
d. 0.3% 过氧化氢室温孵育lOmin，以清除内源性过氧化物酶活性。
e . 蒸锻水冲洗， IxPBS浸 泡 5 min。
f. 0.3% TritonX-100 于 37°C温育 20 min， IxPBS 冲洗， 5 minx3 次。
g. 10% 的正常山羊血清封闭非特异性抗原，室温下孵育 10m in。
h. 倾去血清，勿洗，加一抗：抗-巢蛋白、抗 • 微 管蛋白、抗-GFAP、 抗-GalC。设立阴性对照：用不含一抗的抗体稀释液代替一抗工作液。 4℃过 夜 或 3 7 ℃孵育 2 h。
i. IxPBS 清洗， 5 minx3 次。
j.加链霉卵白素标记的二抗工作液30-400域荧光素标记二抗)，3 7 ℃孵 育 30 min。
k. IxPBS 冲洗， 5 minx3 次 。
l. 加辣根过氧化物酶标记的生物素30——40ul(免疫荧光染色可直接进行荧光显微镜观察)， 3 7 ℃孵 育 30 min。
m. IxPBS 冲洗， 5 minx3 次 。
n. DAB(或AEC)显色液显色，室 温 下 5——10 min， 光镜下观察显色深浅适度后终止染 色 ，自来水充分冲洗，脱水、透明及用中性树脂封片。
(4) 结 果 ：本实验室的研究结果表明原代和第三代神经干细胞培养形成的「神经球 」样结构和消化后的单个细胞呈巢蛋白染色阳性(图4.20)。 神经干细胞在用含 10% 胎牛血清的DMEM/F 1 2 的分化培养基进行培养后，细 胞在 24 h 内即开始贴壁， 48 h 后细胞周围即可长出突起， 3〜 5天后突起逐渐增长，部分突起可相互联系。这些新形成的神经细胞具有不同的形态，其中可见到胞体呈圆形或椭圆形、核大、具 有 1 个 或 2 个突起的
神经元样细胞；也可见到有多个突起、胞核较小的星型胶质细胞。这些细胞包括分别呈G F A P 、 芦微管蛋 白 和 G a l C 染色阳性的细胞 (图4.21〜图4.23)，胚胎脊髓来源的 N SC分化成的神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的比例分别为 (15.8±8.3)%、（72.5±5.0)% 和
(3.6土2.5)%， 胎脑组织来源的N S C 分 化 成 这 3 种神经细胞的比例分别为(16.2土 7.5)%、(74.9±7.0)% 和 (4.8±3.4)%。
神 经 干 细 胞 向 多 巴 胺 能 神 经 元 分 化
研究人员探索了多种诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方案，如使用血清、维甲酸 (YanetaL 2001), 或降低氧浓度(Studer etal.2000)，或添加神经营养因子、造血生长因子 (CarveyetaL 2001)、纹状体条件培养液等。各种条件诱导分化的多巴胺能神经元的比率、存活率、成熟度及分泌多巴胺的功能各有不同，因此很难评价哪种方案最优。故以我室研究的诱导方案为例，简述如下。
(1)材料和试剂：
神经干细胞， D M E M /F 12, B 27, E G F ， b F G F ，抗大鼠多巴胺递质转运子 (dopaminetransportor， DAT)抗 体 ，抗大鼠酪氨酸轻化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗 体 ，抗坏血酸，IL-I，多聚赖氨酸。
⑵ 将 第 三 代 的 中 脑 N S C 消化成单细胞悬液，以 5xl04 个/m l 的密度接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的2 4 孔板内， Iml/孔 ，添加神经干细胞培养液贴壁培养2——3天。
(3) 2〜3天后，去除孔板内的旧培养液，添加诱导培养液： DMEM/F12 , 2 % B 2 7 ，抗坏血酸1〇〇umol1、 1L-1 110pg/ml。置 3 7 ℃ 、 5 % co2培 养 箱 中培养7 天。
抗坏血酸(ascorbic acid, IOOx): AA 0.0176 g 溶于 10 ml PBS 内，浓度为 0.01 mol/L。密闭分装， 4℃保存。
(4) 每 3 天半量换液，第 7 天时终止诱导
(5) 诱导分化效果检测：
a. 中 脑 N S C 在传代过程中D A 能神经细胞数量的变化：取原代细胞和传代培养的细胞，以 5xl04个/m l 接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的2 4 孔板内， Iml/孔 ，2〜 3 天贴壁后撤除生长刺激因子E G F 和 b F G F ，进行自发分化， 7 天后通过免疫细胞化学染色检测酪氨酸羟化酶的表达情况。
b. 取定向诱导分化的细胞进行多巴胺能神经元特异性的功能酶-酪氨酸羟化酶和多巴胺递质转运子的免疫细胞化学检测，步骤同前。
c. 高效液相色谱-电化学检测多巴胺的分泌量，取材及操作方法可参考文献报道(Park et al.2004, Serra et al.2000)
(6) 结 果 ：免疫细胞化学检测发现只撤除生长因子而不加诱导剂的N S C 很少分化为T H 阳性细胞。抗坏血酸及IL-I 均有诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用，诱导分化后的部分细胞表达T H 及 D A T (图4.24)。
血管内皮祖细胞
大量研究表明，胎 肝 、脐带血、骨髓和外周血中均含有血管内皮祖细胞(endothelialprogenitor cell, EPC)，这些内皮祖细胞主要表达CD34、 VEGFR-2、 CD133等表面标志，故利用这些标志可不同程度地富集EPC。 但由•于血管内皮祖细胞与成熟的内皮细胞都具有一些相同的表面标志，包 括 CD34、 VEGFR-2、 Tie-I 、 Tie-2和 VE-钙黏着蛋白(vascularendothelial cadherin) 等 ，所以通过上述标志筛选的细胞中可能混有成熟的内皮细胞。近年来 报 道 CD1 3 3 是 一 种 5 次跨膜的细胞表面分子，分子质量为i 2 〇 kDa，它选择性地表达于骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表面 (Yinet al.1997)。 因此，采 用 CD133分选可排除血管壁脱落的成熟内皮细胞(Quirici et al.2001)。
材 料 和 试 剂 ① M A C S 磁性分离仪、分离柱;② M A C S 磁性细胞分离试剂盒 (C D 133+细胞、U E A -I+ /sup细胞)；③脐带血、夕卜周血或骨髓；④ P B S 缓冲液；⑤淋巴细胞分离液；⑥ E D T A ; ⑦胰
蛋白酶；⑧纤连蛋白；⑨ I M D M 、 M 199培养基；⑩ F B S ; ⑪ V E G F ; ⑫ b F G F ; ⑬ IGF-1;⑭ F I T C 标记的抗荆豆凝集素抗体； ⑫ 抗 人 C D 133、 C D M 、 v W F 、 Tie-2、 K D R 、 C D 105、
V C A M -1(C D 106)、 V E -钙黏着蛋白(C D 144)、 P E C A M -1(C D 31)、 UEA-I 等抗体； ⑭ DiI标 记 的 Ac-L D L ; ⑫ 离 心 管 、吸管、培养板等。
( 1 ) 收集正常人外周血，加入不含防腐剂的肝素 (终浓度为 20U /m l); 或收集经过抗凝处理的脐带血；或无菌条件下，抽取正常人骨髓。
( 2 ) 用 2〜 4 倍 体 积 的 PBS溶液 (添加2 mm 〇 l/L EDTA)稀释外周血或骨髓细胞悬液；用 4 倍体积的 PBS溶液 (添加2 mmol/ L EDTA)稀释脐带血。
(3) 将 35m l 稀释的细胞悬液轻轻叠加到15 mlFiC〇ll-P a q u e 细胞分离液上。
(4) 20℃ 、 400 g 离心 35 min。
(5)收集界面层的单个核细胞，用 PBS洗涤细胞2 次 ， 2 0℃ 、 200 g离 心 lOmin。
(6) 将细胞重悬于 300ulP B S 中 (所含细胞量≤l O 8个)，加 人 100ul F c R 阻断剂，混匀。然 后 加 入 IOOul磁珠稱联的CD133单克隆抗体，细胞悬液总体积为500ul，充分混匀，6——12°C孵育 30 min。
(7) 用 5〜 IOml PBS洗涤细胞2 次 ，以去除未结合的抗体。用500ul PBS(添加2 mmol/LEDTA)缓冲液重悬细胞以备用。
(8) 将分离柱至于磁场中，以 2m l 分离缓冲液冲洗分离柱。
(9) 将 标 记 CD133单抗的细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡，细胞悬液从分离柱下端自然流出。
(10) 用 5 0 0 ul 分离缓冲液洗涤分离柱，洗掉不能结合到柱上的细胞，共 4 次 。
(11) 将分离柱移 出 磁 场 ，加 I m l 分离缓冲液加压洗脱吸附细胞，即 为 C D 133+细 胞 。
内 皮 祖 细 胞 的 培 养 及 分 化⑴ 纤 连 蛋 白 用 P B S 溶 解 稀 释 为 lng/ 4 后 包 被 2 4 孔 板 ，每 孔 中 加 入 100ul，置于3 7℃ 温箱中孵育2 h ，临用前吸出多余的液体，用 P B S 洗 涤 2 次 。
⑵ 将 富 集 的 C D 133+细胞(lxl〇5——2xl05个/c m 2)接种于纤连蛋白包被孔板中，添加内皮细胞培养液。
内皮细胞培养液： M 199 培养基、 10% F B S 、 V E G F 50ng/ml、 bFGF lng/ml、 IGF-I2ng/ml〇
⑶ 将 细 胞 置 于 3 7 ℃ 、 5 % C O 2及饱和湿度的培养箱中培养3——4周，每 3——4天 更 换 培养液。
(4) 内皮细胞的纯化及扩增：
a. 0.25 % 胰酶消化细胞后，用 含 10% F B S 的 I M D M 培养液洗涤细胞2 次 ，收集所有细胞(2xl〇6——4xl〇6个)重悬于1〇〇 ul上述培养液中，并 与 FIT C 标记的抗荆豆
凝集素 (ulex europaeus agglutinin-1， U E A -1)抗体于 4 ℃ 孵育 15 min
b.洗涤细胞2 次 ，重悬细胞，添加 抗 F I T C 的磁珠， 孵 育 15 min。
c. 洗涤细胞，上柱分选出U E A -I+ 细胞(具体步骤参考C D 133+细胞的分选)。
d.将富集的U E A -I+细胞(IxlO5〜 2xl〇5 个/c m 2)接种于纤连蛋白包被孔板中，添加内皮细胞培养液。
e. 将细胞置于37℃ 、 5 % C O 2及饱和湿度的培养箱中继续培养3——4周，每 3〜 4 天更换一次培养液。
(5) 内皮细胞的鉴定：
a.细 胞 表 面 标 志 的 检 测 ：0.25% 胰酶(含1111111〇 1/1^0丁八）消化培养扩增的内皮细胞 ，将 2.5xl〇5磁珠分选的C D 133+细胞或分选后扩增的细胞重悬于5 0 ul含 20%
F B S 的 R P M I -164〇培养液中，分别加入小鼠抗人vWF(von willebrand factor)、Tie-2、 K D R 、 C D 105、 V C A M -1(C D 106)、 V E -钙黏着蛋白(C D 144)等抗体，阴性对照管不加一抗， 4°C 孵 育 30 min， P B S 洗 涤 细 胞 3 次 ，加 入 F I T C 标记的
兔 抗 鼠 IgG, 4 ^ 孵 育 30 min; 或直接加入P E 标 记 的抗人C D 133、 C D 3 4 抗 体 ，F I T C 标 记 的 抗 人 P E C A M -1(C D 31)、 U E A -I 等抗体，阴性对照管加人P E 或F I T C 标记的同 型 鼠 IgG，室 温 孵 育 30 min; P B S 洗 涤 细 胞 3 次 ，进行流式细胞仪分析。或使用上述抗体进行免疫细胞化学染色，观察内皮细胞特异标志的表达情况。
b.乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein, Ac-L D L ) 摄取实验：向贴壁培养的内皮细胞中添加l〇lig/ml D H 标 记 的 A c -L D L (DiI-Ac-L D L )， 3 7 ℃培养 4 h 。收集细胞进行流式细胞仪分析或用激光共聚焦显微镜观察分析。
(6) 结果：
a. 磁珠分选的C D 133+细胞经流式细胞仪鉴定其纯度为(90±5)%， CD133+ 细胞中包 含 的 C D 3 4 + 细胞的比例为(95±4)%， K D R +细胞的比例为(3±2)%，不含成熟内皮细胞(V W F ， V E -钙黏着蛋白等)或成纤维细胞。
b. 细胞形态变化: 分离所得的C D 1 3 3 + 细胞接种于纤连蛋白包被的2 4 孔 板 中 ，第 3〜 4 天可观察到梭形贴壁细胞， 10〜 1 4 天出现多个集落，贴壁的梭形细胞开始从集落的边缘出芽长出。培 养 3〜 4 周 后 ，细胞生长逐渐汇合，以长梭形 细 胞 居 多 ，其中散在成片的鹅卵石样细胞。此时细胞扩增了 (11土5)倍。这些 细 胞 不 表 达 C D 1 3 3 , 而表达内皮细胞标志，如 V E -钙黏着蛋白、 V W E 、
UEA-I 等 。
c.通过磁珠纯化的U E A -I+ 细胞具有较强的扩增能力，继 续 培 养 2——3周 ，细胞可扩增(2228±375)倍。这些细胞可表达内皮细胞标志V W F 、 U E A -1、 C D 105、K D R 、 C D 31、 C D 144等 ，不 表 达 C D 45。它们具有内皮细胞的功能—摄取A c - L D L
骨 骼 肌 源 干 细 胞 的 分 离 培 养
这里仅介绍经典的预种植技术(preplate technique)，该方法主要利用肌肉源干细胞和成纤维细胞、内皮细胞等的黏附性的差异来将M D S C 分离，下面以大鼠为例予以介绍。
(1) 实验动物： 3——8周 龄 SD 大鼠。
(2) 无菌条件下切取大鼠后肢腓肠肌，用眼科剪剪碎。
(3) 在 37T 条件下，依次用以下3 种酶消化： 0.2% 胶 原 酶 X I 消 化 lh， 0.3% dCTP酶 消 化 45 min ， 0.1% 胰酶消化30 min。
(4) 消化后的细胞悬液置于I 型胶原酶包被的培养皿中，培养基为含1〇% 胎 牛 血 清 ，1 0 % 马血清 ， 0 . 5 % 鸡胚提取物及1 % 青链霉素的DMEM培养基。
(5) Ih 后 ，将未黏附的悬浮细胞转移到第2 瓶中，第 1 瓶中再加入新鲜培养基，即为 ppUpreplatel) ; 第 2 瓶在培养2处 后 ，悬浮细胞转至第3 瓶 ；第 3 瓶在培养24 h )^，悬浮细胞转至第4 瓶 ；直 至 第 6 瓶 ，时间间隔均为24 h 。即可获得从p p 1 到 pp6 逐步纯化 的 MDSC其 中 PP1——PP4称作前期种植细胞，PP5——PP6称作后期种植细胞(lateplate, LP)。
(6) M D S C 的免疫组织化学鉴定：具体方法参考4.3.2。
MDSC—般为 CD34+、 Sca-1+、 desmin+、 C d45- 。
骨傲肌源干细胞具有多向分化潜能，除能向骨豁肌、心肌和平滑肌分化外还能向神经 、成骨和造血系分化，下面分别给予介绍。
骨 骼 肌 分 化(1)肌源性干细胞的分离参照前述的预种植方法
(2) M D S C 按 IxlO5 个/m l 的密度种植于铺有1 % 的 I 型胶原酶的培养皿中。增殖培养基：低糖 D M E M 、 20% F C S 、 15% HS(human serum, 人血清)、 6ng/ml 重组人碱性成纤维生长因子rh b F G F 、 100U /m l 青霉素、 100ug/m l 链霉素。
(3) 37℃ 、 5 % C 0 2培养箱培养，每 24 h 加入 6ng/mlrh b F G F 。
(4) 每 3 天换液一次。
(5) 7〜 10天 按 1 传 2 传代。
(6) 在5——10代时进行诱导分化。
诱导培养基：低 糖 D M E M 、 7.5%H S 、 6ug/m l 胰岛素。
(7) 7 天后即可见相互融合的肌管形成和表达横纹肌肌动蛋白和desmin+的骨骼肌纤维。
平 滑 肌 分 化这里介绍一种共培养的方法诱导大鼠M D S C 向平滑肌的分化。
(1) 大 鼠 M D S C 采用预种植技术分离3——8周龄的S D 大鼠的后肢。
(2) 平滑肌细胞取自提供M D S C 大鼠的膀胱，无菌切取大鼠膀胱，用眼科慑和眼科剪逐步分离除去膀胱内外侧的黏膜层和浆膜层，用剃须刀片将平滑肌层切碎， 37℃ 条件下 ，用 0.25% 的胰酶(含 0.02% E D T A )消 化 lh，1 0 0 目筛网过滤除去组织块，细施悬液200 g离 心 5 min，弃上清液。
(3) 将大鼠膀胱平滑肌细胞和M D S C 共培养于I 型胶原酶包被的培养皿中。
培养基：低 糖 D M E M 、 10% F C S 、 10% H S 、 0.5% 鸡胚提取物、 lOOUg/m l 青霉素、100ug/ml 链霉素。
(4) 平滑肌细胞的鉴定通过免疫组织化学检测 平滑肌肌动蛋白(a-S M A )。
成 骨 分 化(1) M D S C 分离同前，采用预种植方法。
(2) 培养条件：采用增殖培养基。
增殖培养基：低 糖 D M E M 、 10% F C S 、 10% H S 、 0.5% 鸡胚提取物、 100U /m l 青霉素、100ug/ml 链霉素。
(3)诱 导 剂 为 200ng/m l 的人重组骨形成蛋白-2(r hBMP-2)，每 3 天换液一次， 37℃，5 % C O 2培养箱中培养。
(4) 培养1周后即可见具有成骨细胞系标记骨钙素 (osteocalcin)阳性的细胞增多。同时 ，可通过反复冻融使细胞裂解，检测碱性磷酸酶(A L P )活性来判定成骨转化。
神 经 细 胞 分 化(1) M D S C 分离同前，采用预种植方法。
(2) 培养条件：采用诱导培养基。
诱导培养基： D M E M /F 12、 20|ig/L rhEGF、 l〇iug/L b F G F 、 2 mmol/L L -谷氨酰胺、
33 mmol/L 葡萄糖、 9.26 g/ml 腐胺、 6.3ng/L 孕酮、 5.3ng/L 亚硒盐、 0.0025 g/L 胰岛素、
O.lg/L 转铁蛋白、 100U /m l 青霉素、 10〇 ug /m l 链霉素。
⑶ 培 养 约 1 0 天后，即可见到表达相应神经标记物的神经元样和神经胶质样细胞。
造 血 系 分 化(I) M D S C 分离同前，采用预种植方法。
⑵ 将 IxlO6个 M D S C 种 于 I O c m 的组织培养皿中， 37℃、 5 % C O 2培养箱培养。
诱导培养基:M E M 、 10% H S 、 100U /m l 青霉素、 lOOug/m l 链 霉 素 ，每 2 天 加 入 5ng/ml干细胞生长因子 (SCF) 和白细胞介素-6(IL-6)，或 5ng/ml S C F 、 Flt-3L 和巨核细胞生长发育因子 (M G D F )。
(3) 培 养 10天后即可见带有造血系细胞标记的分化细胞，如 造 血 干 细 胞 标 记 C-kit阳性细胞出现，可用流式细胞仪检测。
至于骨髓源干细胞向心肌细胞的分化，目前尚存在一定争议，这里不作详细介绍。相信除以上介绍的分化途径以外，还有其他很多方法可用于M D S C 的分离和诱导分化，因此需要依据实验目的和实验对象的不同加以选择。由 于 M D S C 是一种异质细胞群，目前其详细的组成还不清楚，具体实验时还要进行条件的优化和摸索，以上方案仅供参考
胚 胎 肝 脏 干 细 胞 的 分 离 培 养 扩 增 与 定 向 诱 导 分 化
与成熟的肝脏、胰腺和唾液腺相比，胎肝脏中干/祖细胞比例更高，更为原始，具有更弹的增殖分化潜能，免疫原性相对较弱。 Malhi等(2002)从 17——24周孕龄的人胎肝中分离出的大量上皮祖细胞具有很强的克隆形成和增殖能力，体 外 传 4 0 代以上仍保持正常核型 ，表达卵圆细胞特有的表面标志，将原代培养及体外扩增的细胞移植入CCl4损伤的重症联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency, SCID)小鼠体内后，能整合入受体肝脏实质，并且可向成熟肝脏细胞分化。用 FACS方法从孕龄13.5天的小鼠胎肝脏中分选 出 的 C-Met+CD4^ 7 k5 wC-Idr CD45— TER119— 细胞具有高度的自我更新和多向分化潜能，当细胞分别经脾、胆总管及十二指肠壁移植入受体小鼠后，该种细胞可分别向肝脏细胞、胰腺上皮细胞和肠上皮细胞分化 (Suzuki et al. 2002)。
以大鼠胎肝细胞的分离培养为例，此 外 用 0 X43/44 抗体免疫吸附法去除胎肝中的造血干细胞(徐 国 权 2001)，获得较为纯化的胎肝细胞，并对纯化后的胎肝细胞在体外进行培养扩增与定向诱导分化。
实 验 所 需 仪 器 及 材 料 (1)纯 系 S D 大鼠一 ——成年雄性大鼠(体重200±20 g)及 孕 15、 18、 2 0 天成年雌性大鼠。
⑵ 主 要 试 剂 ： I 型胶原酶，小鼠抗大鼠OX43/OX44 抗 体 ，羊抗
小 鼠 I g G 血清， D M E M 培养基、 F 12培养基，兔抗大鼠白蛋白单抗，胎牛血清，淋巴细胞 分 离 液 (P= 1.〇83)， HEPES， 胰 高 血 糖 素 (glucagon) , 胰岛 素 (insulin)，氢化可的松(hydrocortisone) , 转铁蛋白(transferrin) , 表皮生长因子 (epidermal growth factor) , 砸酸盐
(sodium selenate) ，尼 克 駄 胺 (nicotin-amide) ，亚 油 酸 (linoleic acid) ， 醋 酸 维 生 素
E (a-toC〇 pher 〇lacetate)，维生素 C ，甘氨酸(glycine) , 甲状腺素(triidothyronine， T 3)等。
(3) —次性无菌离心管，细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶等。
方法1 ) 孕 周 确 定 方 法
采 用 12 h 昼/12 h 夜饲养周期，一雌二雄同笼过夜，次晨雌鼠阴道分泌物涂片检查有阴栓出现确定为妊娠雌鼠，孕 周 为 O 天。孕 15、 18、 2 0 天 雌 性 S D 大鼠行剖宫产术取胎鼠。
2 ) 胎肝细胞分离
⑴手 术 方 法 : 怀 孕 雌 性 S D 大 鼠 术 前 12 h 禁 食 ， 4 h 禁水。动物称重后按照 30 mg/kg肌肉注射 0.3% 戊巴比妥钠溶液，麻醉后仰卧固定于动物手术台，8 % 硫化钠腹部脱毛备皮，乙醇、碘伏消毒后铺无菌孔巾。取下腹正中切口，长 约 4c m ，进腹。可见怀孕大鼠为双子 宫 ，肌层透明，胎鼠清晰可见，依次排列， 7——12 只数目不等。分离子宫各韧带后将双子宫完整切除，置于含 4°C H a n k 缓冲液无菌培养皿中，母鼠依次缝合关腹。
(2) 分离方法：将盛有子宫的无菌培养皿转移至超净工作台冰浴盒上操作，剪开子宫肌层及胎膜，去除胎盘脐带， Hank 缓冲液洗净羊水及血液。剪开胎鼠腹壁，完整取出胎肝、，去除胆囊后用 Hank 缓冲液洗净血液，手术刀切割成 ImmxImmxImm 大小的组织块 ，置 于 15m l 无菌离心管中。
⑶ 无 菌 离 心 管 加 入 0.05% 胶原酶缓冲液，比例为 O.lg/m l ，将无菌离心管置于37℃温水浴振荡箱中振荡 15 min，频 率 5 0 次/min。无 菌 lOOium 尼龙滤网过滤 2 次 ，未消化组织块在无菌细胞培养皿中用无菌玻璃试管底机械法研磨为组织勻浆，加 入 H a n k 缓冲液过 滤 ，过滤后胎肝组织悬液低温离心机离心 2 min，转 速 l2 〇 Or/min。细胞沉淀用 H a n k 缓冲液重悬，重复上述操作一次。最 后 加 入 H a n k 缓冲液制成单细胞悬液。台盼蓝活性检测 ，细胞计数。
3 ) 胎肝细胞纯化
(1) 将分离的胎肝细胞悬液按体积比 1 : 1 0 的比例加入红细胞裂解液，置于无菌离心管中，低温机离心3 min、，转 速 1200r/min。
⑵ 离 心 后 小 心 去 除 上 清 ，用 含 0 X 4 3 抗体(15ug/ml)、 0 X 4 4 抗体(18ug/ml) 的完全培 养 基 D M E M 2m l 加入到无菌离心管，将细胞沉淀重悬，吸附造血干细胞， 静置IOmin0
(3) 同时将羊抗小鼠 I g G 血 清 稀 释 10 倍 ，取 IOml 平 铺 于 90 mm 无菌培养皿 B 中，使之完全覆盖培养皿底，室温孵育 40 min。
(4) 磷酸盐缓冲液漂洗无菌培养皿 3 次 , 用 含 1 % 胎牛血清的 H a n k 缓 冲 液漂洗 1 次。
(5) 将无菌离心管 A (含胎肝细胞)中的纯化培养基小心加入含羊抗小鼠IgG 血清无菌培 养 皿 B 中， 4 ¾ 静 置 lOmin。 将造血干细胞免疫吸附沉淀到无菌培养皿 B 底部。
(6) 无菌巴斯德吸管小心吸取无菌培养皿 B 中的上清，内含未被吸附的细胞，用磷酸盐缓冲液小心漂洗培养皿 3 次 ，收集上清及漂洗液，低温离心 2 min，转 速 1200r/min。获得的细胞沉淀即为纯化后的胎肝细胞。
(7) 2m l H a n k 缓冲液重悬细胞沉淀，细胞计数，台盼蓝活性鉴定。
纯 化 胎 肝 干 细 胞 培 养 1 ) 条件培养基的配制
胰 高 血 糖 素 100ng/ml，胰 岛 素 lOug/ml，转 铁 蛋 白 10ug/m l，氢化可的松 60mg/ml，甲 状 腺 素 50mnol/L ， 表 皮 生 长 因 子 25ng/m l， 硒 酸 钠 5ng/m l， 甲状腺素，尼克酞胺
10 mmol/L ，亚 油 酸 50ng/ml, 醋酸维生素 E 1 ug/mi， 维 生 素 C O.lmmol/L ， 其他成分同普通培养基。
2 ) 条件培养液体外诱导胎肝干细胞定向分化
将分离富集的胎肝细胞浓度稀释为IxlO6个/ml， 取 0.5m l 接 种 于 2 4 孔培养板 (2 cm2/孔)， 接种密度为2.5xl〇5 个/c m 2, 加 入 l .5m l 条件培养基。培养 条 件 3 7℃ 、 5 % C0 2。 培
养 18〜 20 h 后 H a n k 缓冲液冲洗后去除未附壁的胎肝细胞，更换培养基。以后每 24 h 更换一次培养基。
骨髓来源的干细胞具有多向分化潜能。特别是具有向肝脏干细胞、肝脏细胞及血管内皮细胞分化的潜能 (FerrarietaL 2000)，加之其具有来源丰富，取材方便，操作技术相对成熟，源于自体，无免疫排斥问题等优势，因而有望成为肝脏组织工程或肝脏再生细胞治疗中新的种子细胞来源。自 1999 年首次发现大鼠的骨髓细胞可以分化为肝脏卵圆细胞 ，并进而分化为肝脏细胞和胆管上皮细胞以来，不断有研究结果支持这一观点。然而也有一些研究提出了骨髓源性干细胞在肝内与肝脏细胞融合的证据，认为肝内出现的新
标志细胞是植入细胞与受体肝脏细胞的融合而不是由干细胞转分化而来。有报道在对初始细胞状态、分化环境等严格控制的条件下，证明骨髓干细胞可以转分化为肝脏细胞而没有发生细胞融合，当骨髓干细胞与损伤的肝组织 (或细胞)在分隔的体系中共培养时，损伤肝脏组织 (或细胞) 分泌的因子刺激了干细胞向肝脏细胞分化的潜能，但由于骨髓干细胞不与肝脏组织直接接触因此排除了细胞融合的可能性，并且骨髓干细胞在移植人肝脏损伤大鼠体内后，随着肝组织损伤程度的增加，干细胞转化为有活性的肝脏细胞，肝
脏功能在细胞移植后 2——7天将得以恢复 (Jang et al.2004)。
迄今为止，人们把骨髓中存在的干细胞分为 3 类 (尽管 3 类细胞之间在界定上有不同程度的不确定及交叉): 造血干细胞(hematopoietic stem cell,H S C )，间充质干细胞(mesenchymalstem cell, M S C )和多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cell, M A P C )。骨髓内含有如此多种细胞类型，具体是哪种细胞群体能分化为肝脏细胞，目前各家报道尚不一致，这将涉及多个细胞表面标记，既有造血系细胞，又有间质系细胞，因此寻找可以纯化的骨髓源性肝脏干细胞的确切的表面标记显得尤为重要。P2 微球蛋白(P2M )是哺乳动物体内广泛表达于有核细胞表面、最具保守性的蛋白质，由于其不出现于某些永生性生长的肿瘤细胞及囊胚期 E S 细胞表面，因此 p2] VT细胞被认为是具有旺盛增殖潜能的细胞；此外，
骨髓中造血干细胞表面标志 Thy-I+细胞具有向成熟肝脏细胞分化的潜能。故推测，骨髓来源的 Thy-I+P2JVT 细胞(bone marrow derived Thy-I+P2N T cell,B D T C 河能是骨髓中的肝脏干/祖细胞(Avital et al.2001)。
本实验采用两步间接免疫磁珠分选的方法得到骨髓中表面标志 Thy-I+P2AT 的细胞，并通过添加因子直接培养的方法以及 Tm nsw dl 体系共培养的方法诱导骨髓来源肝脏干细胞进行体夕卜定向诱导分化
1 ) 实验所需仪器及材料
①近 f 系 Fisher344 大鼠；②大剪刀以及小剪刀 (各 2 把)，镊子 ( 2 把)，无菌托盘；③全自动高速冷冻离心机；④超净工作台；⑤普通光学显微镜；⑥胎牛血清， DM EM 培养 基 ； ⑦ M ACS磁性分离仪、分离柱；⑧ M ACS磁性细胞分离试剂盒(抗CD34抗体、磁珠)； ⑨ P B S 缓冲液；⑩ 200 呵 钢筛网； ⑪ IOm l 离心管，吸管， IOOmm 组织培养皿 ，纱 布 ；⑫ 一 次 性 5 ml、IOml 注射器；@ 羊抗 兔 I g G 标记的免疫磁珠；⑭ 兔 抗 大 鼠 Thy-1、P2M 多克隆抗体； ⑫ 淋巴细胞分离液 (Ficoll， p = 1.083 g/ml)。
2 ) 大鼠骨髓来源的 Thy-l+p2M-细胞分离方法
(1) 准备近交系 Fisher34 4 大鼠，体 重 150——180 g ，饲养于清洁级、 2 2℃恒温鼠房， 12 h交替照明，自由进食和饮水，实 验前 2 天单独喂养；
(2) 将 F344 大鼠断颈处死 ， 70% 乙醇浸泡 IOmin 清洗消毒后置于无菌托盘内；
(3) 无菌条件下剥皮，分别从大鼠的肩关节和髋关节处解剖四肢，切除爪，取出四肢骨放入盛有 P B S 的 IOOmm 组织培养皿中，反复冲洗四肢骨表面残留血细胞，将冲洗干净的四肢骨移入另一含10% 胎牛血清的DM EM 培 养 液 的 IOOmm 组织培养皿中，使用剪刀镊子断离两侧骨骺，通 过 5m l 注射器用完全培养液反复冲洗骨髓腔以及富含骨髓细胞的骨飯，尽量将骨髓细胞完全冲出；
⑷ 将 冲 出 的 骨 髓 细 胞 经 2〇〇目筛网过滤后，重悬于培养液中形成细胞悬液，然后在 无 菌 IOmI离心管中加入 5m l 淋巴细胞分离液，再缓慢沿管壁加入5m l 细胞悬液，2〇°C 、1500r/m i n 离 心 20 min，分离出单个核细胞；
(5) 收集中间的单个核细胞层，用 DM EM 培养液离心 (1500r/min、 5 min) 洗 涤 2 次 ；
(6) 加入 兔 抗 大 鼠 抗 体 10 W 轻轻混勻后，4℃ 孵育30min,1500r/min离 心 5 min,P B S 洗 2 次;
(7) 加入磁珠标记的羊抗兔 1 gG ， 孵 育 30 min, 1500r/min离 心 5 min， P B S 洗 2 遍;
(8) 将分离柱固定于M A C S 磁场内，用除 气 的 M A C S 缓冲液 (真空抽气)2m l 冲洗分离 柱 ；
(9) 将单细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡，以 2m l除气的M ACS 缓冲液洗涤，收集洗脱组分， 2000r/min离心，弃上清，得到 p2M_细胞；
(10) 将收集到的 P2NT细胞再先后与兔抗大鼠 Thy-I 抗体和磁珠标记的羊抗兔 IgG 4℃ 孵育；
(11) 细胞洗涤后经 MACS 高梯度磁场分选， Thy-I+细 胞 被 MACS缓冲液冲出；将磁 性 分 离 柱 移 离 磁 场 ，用缓冲液洗脱滞留于分离柱内的细胞，得到大鼠骨髓来源的Thy-l+p W 细胞(BDTC)，台盼蓝染色检测细胞存活率大于 9 5 % ，细 胞 置 代 备 用 。
注意：以上操作均严格按照无菌操作规程。
骨髓来源肝脏干细胞的增殖分化主要受到细胞因子和(或) 生长因子的调控。研究表明 ， 抑瘤素(oncostatin M ， OSM)、 表皮生长因子 (EGF)、 FGF、 肝脏细胞生长因子(HGF)等在肝脏损伤后修复和再生的不同时期均发挥一定的作用 (JauregUi et al. 1999)。采用特定肝脏细胞培养液，以 HGF 和 EGF 诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝脏细胞样细胞定向分化。
4.6.2.2.1 直接法诱导骨髓 Thy-1+ P2IVT(bone marrow derived Thy-I + P2M-cell,BDTC)的细胞向肝脏细胞分化
1 ) 实验所需仪器及材料
①胎牛血清，尚 糖 D M E M 培养基；②全自动高速离心机；③ IOml离心管，吸管；④ Hepes; ⑤地塞米松；⑥表皮生长因子(E G F )，肝脏细胞生长因子(H G F );⑦ 6 孔培养板;⑧超净工作台；⑨胰蛋白酶；⑩ Matrigel。
2 ) 骨髓来源肝脏干细胞的诱导分化
将收集的大鼠 BDTClxlO4个/孔的密度接种于铺有 2 mg/L Matrigel的 6 孔培养板中，条件培养液为尚糖 DMEM， 其 中 含 10% 胎牛血清、 20 mmol/LHepes、 10_7mol/L 地塞米松 、 20|ig/LHGF、 2(^g/LEGF 及 部 分 微 量元素和青链霉素，隔 日 半 量 换 液 1 次 。
4-6.2.2.2 Transwell 体系共培养诱导骨髓 Thy-I +P2IVT细胞向肝脏细胞分化
有证据显示肝脏损伤后释放的大量促进肝再生的可溶性细胞因子及生长因子等构成/ 适宜的微环境 (Gonzalez-Reyes et al. 2003), 所以我们通过利用 Transwell 体系共培养BDTC 和丙烯醇 (allyl alcohol, A A ) 损伤的肝脏细胞，并且添加适当细胞因子和生长因子，在体外通过细胞工程的方法，创造适于干细胞增殖和向肝脏细胞分化成熟的环境，以骨髓干细胞作为种子细胞，大量生产有功能的肝脏细胞。
1 ) 灌注法 A A 损伤肝脏细胞悬液的制备的材料
① 9——10 周龄、体 重 150〜 170 g 的 Wistar 大鼠； ②输出速度为 4〜60 ml/min的蠕动泵；
③ 桂胶管 (0.078 IDx0.125OD) ; ④外科手术器械 (大、小组织剪、镊子、止血钳、 18 号套管针、 4 号手术丝线、棉球、纱布等)； ⑤ 7 5 % 乙醇； ⑥戊巴比妥钠(sodium pentobarbital);⑦ 8 0 目微孔滤膜；⑧细胞培养基(RPMI1640、 10% F C S 、 10-7mol/L 地塞米松10ug/ml胰岛素、 5ng/ml 转铁蛋白)。
2 ) 灌注法 A A 损伤肝脏细胞悬液的制备
(1) 提 前 24 h 经腹膜内注射 A A 0.62 mmol/kg， 建立急性肝衰竭模型。
(2) 用 500m l 无菌水灌注管道，调整螺动泵的流速为 16 ml/min。
(3) 腹膜下注射 0.2 ml/200 g 戊巴比妥钠麻醉大鼠，固定并消毒大鼠，以 E G T A 溶液灌注管道。
(4) 在一对止血钳的配合下，沿正中线从耻骨到胸骨打开腹腔，沿切口的中线做水平切口，充分暴露腹腔；以蘸 E G T A 的棉球将肠管推开，暴露肝脏；轻轻上翻肝叶，暴露门静脉和下腔静脉；在右肾静脉分支上方用丝线将腔静脉打一活结；分别在离肝脏较近和较远处的门静脉下方置两根丝线；在眼科镊子的协助下进行门静脉穿刺，穿刺点位于距进入肝叶的静脉分支约 1.5c m 处。操作过程注意保持套管针与门静脉的平行以免刺破血管后壁，拔除套管针后立即打双结，将管道连接至套管，开始灌注。
(5) 在肾脏下方切断腔静脉，肝脏立即变白；入胸腔切断腔静脉。扎紧肾脏上方的腔静脉，用纱布吸净胸腔内的积血/液。
(6) 继 续 灌 注 EGTA 液 体 4 min，停 泵 ；换 IxLeffert 缓冲液，灌 注 2 min，停 栗 ；加入消化液灌注，直至肝脏裂开，停 泵 ；除去胸腔内的积液。
(7) 用消过毒的止血钳和剪刀切下消化理想的肝叶部分放人培养皿中；向消化的肝叶加入冰冷的CaCl2 溶液，用 2 把解剖刀分离肝叶。
(8) 在橡皮细胞刮子的协助下，用 8 0 目滤网及漏斗过滤细胞至 150 ml H B S S 平皿内，将细胞转移至 50m l 离心管中， 50 g 离 心 1〜 4 min; 用清洗缓冲液重悬细胞，洗 3 次 ；以10——20 ml CaCl2 溶液重悬细胞。
(9) 向 80ul H B S S 中加入 IOul细胞和 IOul 〇• 4 % 台盼蓝，在显微镜下观察细胞活力。
B D T C 诱导体系的建立1 ) 材料与方法
(1) D M E M /F 12 完全培养液。
(2) 条 件 培 养 液 ：向 完 全 培 养 液 中 加 入 lxITS、尼 克 酰 胺 0.61 g/L、地塞米松0.lunmoL/L 、牛血清白蛋白(B S A )2 g/L 、葡萄糖 lg/L 、半乳糖 2 g/L 、鸟氨酸 0.1 g/L 、脯氨酸 0.03 g/L 、谷氨酰胺0.73 g/L 及适量微量元素(氯化梓、硫酸锌和氯化猛)等 。
⑶ 细 胞 因 子 和 生 长 因 子 ： h H G F 和 b F G F 。
⑷ Tmnswell 培养板。
(5) Matrigel。
2) 细胞培养的放置
将从灌注法中获取的 A A 损伤的肝脏细胞按 3x IO4个/c m2 接种于铺有 I 型鼠尾胶原的 Tmnswell 培养板上室，将 BDTC 按 5x l〇4个/c m 2 接种于铺有 Matrigel的下室 (图4.26)。
态的变化。
检测方法
1) 普通光镜观察
在 B D T C 与 A A 损伤肝脏细胞共培养体系的下室中，接种的部分 B D T C 于诱导第 7天体积明显增大，核浆比例大，出现大而圆的单个、双个甚至多个细胞核，细胞质丰富，部分细胞处于分裂相；相反 ， B D T C 与正常肝脏细胞共培养组及单独培养时均未见其^态发生变化 (图4.27)。
2 ) 透射电镜形态观察肝脏细胞超微结构
B D T C 诱 导 至 7 天时，取出共培养体系中的上室，以 3 % 戊二醛于培养皿原位 4℃ 前固 定 2 h ，以 1 % 锇 酸 4 1 后 固 定 Ih后 ，蔗糖缓冲液反复漂洗，梯度乙醇脱水、入丙酮后，以树脂渗透、包埋、聚合，用 U L T R A C U T E /S 型切片机超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双
重染色， Philips C M 120 透射电子显微镜观察细胞超微结构。
3 ) 免疫细胞化学检测
将 诱 导 7 天的细胞用胰酶消化 后 50 g 离心、诱导前的细胞 500 g
离心后分别制成细胞悬液，细胞甩片 ，多聚甲醛固定和羊血清封闭后 ，分 别 与 抗 Thy-I 、 白蛋白(albumin， Alb)和 甲 胎 蛋 白 (AFP)抗体孵育，以 S P 试剂盒进行免疫细胞化学检测， D A B 试剂盒显色。
4 ) 细胞培养上清中尿素和白
蛋白的产量诱导分化 7 天 的 BDTC 经 PBS冲洗换用无血清的D M E M 培养基，加 入 〇.15mol/L 的 N H 4Cl, 常规培养 8 h 后收集细胞
培养的上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素和白蛋白的分泌量。
5) ICG(indocyaninegreen， 靛青绿)摄取、排泌实验将诱导分化7 天 的 B D T C 用 P B S 冲洗后，加 入 lmg/nj I C G 于 37T ：孵 育 15 min 后 ，显微镜下观察细胞颜色的变化。再 用 P B S 冲 洗 2 遍 ，换回完全培养液继续常规培养，并
观察细胞颜色的变化(图4.28)。
6) RT-PCR 方法检测
还 可 以 用 R T - P C R 的 方 法 检 测 B D T C 诱导前、后肝脏细胞相关基因 (A F P 、 Alb 、C T P 257、 C X /S 、 CXZ9 、 HNF和 ; 等 ) m R N A 的表达变化等
密 度 梯 度 离 心 法 分 离 成 人 胰 腺 导 管 上 皮 干 细 胞 实 验 所 需 仪 器 及 材 料
①调温低速离心机；②电子天平；③普通光学显微镜；④成人尸体供者来源的胰腺组 织 ；⑤ H B S S ;⑥ V 型胶原酶；⑦单核细胞分离(Histopaque);⑧离心管、吸管、培养板等。
成 人 胰 腺 导 管 上 皮 细 胞 的 分 离(1)取成人尸体胰腺，于解剖显微镜下去除周围的脂肪和结缔组织，冷 Hank 缓冲液冲 洗 2 次除去血迹；
⑵ 于 胰 腺 内 灌 注 0.5m g /m l V 型胶原酶，(2 ml/g 组织)，于 3 7℃ Hank 缓冲液中(HBSS)消 化 25〜 30 min, 可见少许散落组织，并可见胰腺组织变松散；加 冷 Hank缓冲液终止消化 ，弃去消化液；以含0.5% 牛 血 清 白 蛋 白 的 代 的 HBSS 冲洗和离心(llOOr/min， 20s)2次 ，此时大部分胰腺仍呈完整团块状；加 冷 H a n k 缓冲液用吸管反复吹打至团块消失，将 其 滤 过 1 5 0 目的尼龙筛网，以除去未被消化的大块组织。
⑶ 密 度 梯 度 离 心 法 ：先将过滤后的细胞悬液与 5m l 最高密度的 Histopaque(l.119 g/ml) 混 匀 于 50m l 离心管中，再分别将密度为l. 〇 98 g/ml、 1.077 g/ml Histopaque 和 H B S S各 5m l 分别缓慢沿管壁加入于其上，代 、 1500r/m i n 离 心 20m i n 后 ，分别从三个界面(H B S S /1.077、 1.077/1.098、 1.098/1.119)和离心管底部收获细胞，胰岛多在第一和第二界面 (H B S S /1.077、1.077/1.098)，而我们所要的大量外分泌细胞和导管上皮细胞则主要位于
第三界面(1.098/1.119)和离心管底。收集细胞后， H B S S 洗 涤 2 次 (1500r/m i n 离 心 5 min)，悬浮细胞计数，备用。
①超净工作台；②二氧化碳孵箱；③ 无 糖 DM EM 培养基；④胰岛素抗体；⑤胰高血糖素抗体;⑥尼克酰胺 (nicotinamide);⑦胎牛血清;⑧碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);⑨表皮细胞生长因子(EGF); ⑩ N 2 添加剂。
成 人 胰 腺 导 管 上 皮 细 胞 的 培 养 扩 增(1) 收获的细胞按 Ix lO 5个/ m l的密度分别接种 3 m l 于 2 5 m l 培 养 瓶 和 I2 孔板 (每孔1m l ，加鼠尾胶原铺板的玻片)，培 养 在 含 1 0 % 胎 牛血清的D M E M 培养液中， 3 7 ℃ 、 5 %C O 2培养箱中培养，培 养 液 中 添 加 lOO U /m l 青霉 素 ， l 〇〇 U /m l 链 霉 素 ， 500 ug/l两性霉素 B 。
(2) 培 养 24 h 后换液，沉降后弃上清，加 含 b F G F 、 EGF 各 20ng/ml 和 1 % N2 添加剂 的 D M E M 培养液(不含血清) 继续培养。
(3)培 养 36 h 后弃去悬浮的细胞和胰岛; 然后用加含 b F G F 、E G F 各 20ng/m l 及 1 % N 2添加剂的D M E M 培养液(不含血清)培养，以后每 48 h 换 液 1 次 ；待形成类胰岛样细胞团后在培养基中添加浓度为 17.8 mmol/L 的葡萄糖、 l〇 m mol/L 的尼克酰胺和 2 % 胎牛血清，
继续 培 养 5 天 ，可见类胰岛团明显增多，经吸管吹打脱落，镜下手工挑选、收集类胰岛样细胞团。
(1) 光镜观察: 第 1、 3、 5、 7、 9、 15、 21、 2 7 天收取培养于玻板上及培养瓶中的细胞于普通光镜及相差显微镜下观察；
⑵ 电 镜 观 察 : 第 5 、 9 、 15、 21、 2 7 天 ，部 分 细胞以 2 % 戊二醛固定，环氧树脂包埋 ， 2um 切 片 ，光镜观察，选 适 当 区 域 作 80n m 超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，电镜观察；
(3) 分别在培养24 h 、 36 h 和 1 周后取出玻片，检测巢蛋白(nestin)、胰岛素及胰高血糖素表达；
(4) 胰岛素释放实验：取分离后的胰腺消化组织悬液 lml，用双硫腙染液(双硫腙IOmg, 99.5% 乙 醇 3m l ， 2 5 氨 水 50叫)进行染色， 5 min 后显微镜下观察。镜下手工挑选胰 岛 ，每 次 4 0 个 ，共 3 次 ，每次分别放入葡萄糖含量为 3.3 mmol/L 和 16.7 mmol/L 的 2 ml
H a n k 缓冲液(含 5 % F B S )中， 3 冗 、 5 % C 0 2培养箱中培养 lh; 离心收集上清， -20℃ ：保存 。同样方法收取培养出的类胰岛样细胞团 4 0 个 。胰岛素测定采用放射免疫法。
经尼克酰胺和高浓度葡萄糖等诱导分化后，细胞突起开始回缩、变 短 ，增长速度加快 ，培 养 约 2〜 3 周后细胞相互聚集形成上皮样团块，类似胰岛样组织，免疫细胞化学染色显示部分细胞呈胰岛素免疫阳性反应，少数细胞为胰高糖素免疫反应阳性。随时间延长 ，胰岛素和胰高血糖素免疫染色阳性细胞数目增多，染色增强。放射免疫法测得细胞上清有胰岛素的分泌，葡萄糖含量高的细胞上清中，胰岛素分泌量也高
皮肤干细胞的扩增及定向诱导分化
皮肤作为人体最外层的防御系统，具有极强的修复和再生能力。尤其是表皮，由多层角质细胞构成，其基底层存在着对皮肤再生、损伤修复起决定作用的干细胞群，称为表皮干细胞(epidermal stem cell)。它可通过对称分裂或非对称分裂的方式产生定向祖细胞即短暂增殖 (transient amplifying, T A ) 细胞(Jones etal.1993)，继而分化为表皮细胞、毛囊和皮脂腺。皮肤表皮干细胞这种特有的生物学特性，使之不仅对皮肤的动态平衡的维持发挥作用，而且对皮肤的损伤修复以及皮肤遗传性疾病、皮肤肿瘤等疾病的基因治疗具有十分重要的意义。
早期在对表皮细胞进行体外培养时，根据形成克隆的大小及其不同的增殖潜能，分为 3 种 类 型 ，包括来 源 于 表 皮 干 细 胞 的 Holoclone 和 来 源 于 T A 细 胞 的 meraclone、paraclone。尽管由此显示了表皮干细胞强大的增殖潜能，但对其分离鉴别仍存在限制。目前对表皮于细胞的体外分离方法主要有两种。一是选择特异的表面标志通过流式分选进行分离，如已发现的 P1 整联蛋白、 K 19、 K 1 5 等 ，由于它们并不能特异地代表表皮干细胞的表达，因而应用受到一定的限制。P6 3 为 P5 3 家族成员之一，近年来研究发现 (MillsetaL 1999, Yangetal.1999)，它可将表皮干细胞和 T A 细胞很好地区分开来，因此作为表皮干细胞的筛选标志，其具有一定的特异性。此 外 ，^ Catenin 作为黏附连接的结构部
分 以 及 wingless/W n t 信号通路的下游效应器，其磷酸化后在表皮干细胞的表达水平远髙T A 细 胞 ，因此也可作为一种区分标志。二是利用其对基底膜具有快速黏附的特性进行初步筛选，再根据其克隆形成能力进行单克隆培养。下面就以两种方法相结合，介绍人表皮干细胞的分离培养、鉴定及分化(Jiaxi et al.2004)。
流式细胞仪、 D M E M 、 H a m F -12、 F B S 、 E G F 、转铁蛋白、腺嘌呤、胰岛素、霍乱毒素、氢化可的松、鼠 P1 整联蛋白-F I T C 单抗、鼠 IgG-F I T C 抗体、 P6 3 抗体、外皮蛋白抗体、 nestin 抗体、磷酸化在 Catenin 抗体、牛血清白蛋白。
方 法人 胎 儿 基 底 角 质 细 胞 的 分 离 培 养
⑴ 取 胎 儿 全 层 皮 肤 ，用 0.25% 的胰蛋白酶和 0.02% 的 E D T A 4℃ 过夜消化。
(2) 接种于丝裂霉素 C 处理过的N I H 3T 3 细胞滋养层上，加入下述培养基。培养基组成： D M E M 和 H a m F -12(3 : 1)、 1 0 % F B S 、 20ng/m l E G F 、 5 ug/ml转铁蛋白、 1.8xl0-4m ol/L 腺嘌呤、 5ug/ml 胰岛素、 10-10mol/L 霍乱毒素、0.4ug/ml 氢化可的松。
(3) 置 于 37℃ 、 5 % C O 2、饱和湿度的孵箱内培养。
⑷ 每 2 天 换 液 1 次 。
(5) 细胞长到 8 0 % 融合时，用 0.02% E D T A 去除滋养层细胞后，胰蛋白酶- E D T A 消化传代。
流 式 细 胞 仪 分 选 标 志 细 胞⑴ 取 传 1 代的角质细胞，用 1 % B S A 清洗。
⑵ 加 入 1 % B S A 及 F I T C 标记的 Pi 整联蛋白抗体， 3 7℃孵 育 lh。
⑶ 1 % B S A 清 洗 3 次 。
⑷ 用 70 哗 的 细 胞 筛 网 过 滤 。
(5) 加 入 PI(l( ag/ml) 染色液， 4 1 避光保存 30 min。
(6) 上流式细胞仪进行分选。
免疫荧光检测(1) 细 胞 用 4 % 多聚甲醛室温固定 lh。
⑵ P B S 洗 3 次。
(3)用 Triton X-IOO 处理 lOmin。
⑷ P B S 洗 2 次。
(5) 加入一抗室温过夜孵育。
(6) P B S 洗 3 次后，加 人 F I T C 标记的二抗， 3 7 ^ 孵 育 45 min。
(7) P B S 洗漆后，加 入 pi，室温孵育2 min。
(8) P B S 清 洗 ，共聚焦显微镜观察。
电 镜 观 察经流式分选出的细胞用戊二醛固定，行常规脱水、浸透及包埋后，透射电镜下观察。
分 选 出 的 表 皮 干 细 胞 的 培 养(1) 分选出的表皮干细胞以 IO5个/孔的细胞密度接种于铺有 I V 型胶原 (100ug/ml) 的2 4 孔板中。
(2) 加入上述培养基，置 于 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2、饱和湿度的孵箱内培养。
(3) 每 2 天 换 液 1 次 。
(4) 镜下观察细胞形态。
细 胞 克 隆 形 成 能 力 的 测 定(1) 将分选的细胞接种于6 孔板上，密 度 为 1000个细胞/孔 (6 孔板用前 24 h 铺上用丝裂霉素 C 处理过的滋养层细胞)。
⑵ 加 入 上 述 培 养 基 ，置 于 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2、饱和湿度的孵箱内培养。
(3)每 2 天 换 液 1 次 。
⑷ 培 养 2 周 后 ，细胞用福尔马林固定。
(5) P B S 清 洗 ， 1 % 罗丹明染色。
(6) 镜下计数克隆数，每个克隆至少包括 3 2 个细胞。克隆形成率(％)(C F E )=克隆数/接种细胞总数 X 100。
悬 浮 诱 导 终 末 分 化⑴分选细胞置于上述培养基中，包 括 1.6% 甲基纤维素。
(2) 37℃ 培 养 2 他 后 ，收集细胞进行免疫组化分析。
(3) 细胞用甲醇和丙酮 (I : 1)的混合液室温固定 lOmin。
⑷ P B S 清 洗 3 次。
(5) 加 入 一 抗 代 过 夜 孵 育 。
(6) 下述步骤同 2.3 免疫炎光检测。
结 果 胎 儿 基 底 角 质 细 胞 的 培 养在分选胎儿 (大于2 0 周龄) 基底细胞时，其表皮很容易从真皮层分离。对于更小胎龄的胎儿，由于分离不彻底，因此很容易混杂真皮成纤维细胞。而污染的成纤维细胞在培养时可阻止角质细胞的生长。分离的胎儿角质细胞在丝裂霉素 C 处 理 过 的 N I H 3T 3 细胞滋养层上生长良好，并 可 形 成 3 种类型的克隆，即 holoclone、 meraclone 和 paraclone。大部分克隆为 holoclone，具有高度的增殖潜能。同时在克隆中央有一些分层的细胞。培养 2 周后，来源于不同胎儿的角质细胞在形态和增殖潜能上无明显差别。
流式分离表皮干细胞根据 P1 整联蛋白表达的高低，经流式分选出的细胞中的 P1 整联蛋白表达量最高的一群细胞定义为表皮干细胞，而另一群 P1 整联蛋白表达量较低的细胞定义为 T A 细胞。
表 皮 干 细 胞 的 分 子 标 志为了对分选出的各类细胞进行鉴别，采用免疫荧光的方法对人表皮干细胞的表面标志进行检测。结果发现分选出的细胞中都髙表达口! 整联蛋白和磷酸化的P_catenin。而尸纪在定义的表皮干细胞的细胞核中有表达，表明这类细胞即为表皮干细胞。
表皮干细胞的形态电镜下，分选出的表皮干细胞核大，胞质少，胞质细胞器较少，表明这群细胞具有原始细胞的特征。而 T A 细胞核小，胞质比例较大，胞质细胞器也相应较多。
表 皮 干 细 胞 的 增 殖当表皮干细胞接种于铺有 IV 型胶原的孔板后，9 5 % 的细胞在20 min 内黏附于孔板底部 。开始表皮干细胞生长缓慢， 6 天 后 ，其增殖加速， 1〇天后细胞融合。而 T A 细胞则在 7 天内达到融合。表明干细胞进入增殖周期较了入细胞慢。
表 皮 干 细 胞 的 集 落 形 成 能 力縛 14 雜 ，财 辦 赚 自 ，通 賊 克 麵 。经统计细胞的克隆形成率为(35. 6±5. 4) % ，而 T A 细 胞 的 克 隆 形 成 率 为 (4 訊 1)%。表月分选出的表皮干细胞比 T A 细胞具有更强的增殖能力。
表 皮 干 细 胞 的 终 末 分 化分选细胞置于含有1. 6% 甲基纤维素的培养基后培养。外皮蛋白，标志着分选细胞向角质细胞的终末分化。
注 意 事 项表皮干细胞的鉴别主要是根据其表面标志和克隆形成率这两个参数进行的。该方法所获得的胎儿表皮干细胞的克隆形成率较报道的略低，分析可能是因为分选效率或胎儿和成人口: 整联蛋白的表达存在差别所致。总之，由于目前并未寻找到皮肤干细胞表达的特异性标志，因此对其分离、纯化的技术手段及体外诱导分化的各种培养体系尚不成熟，有待于进一步研究
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