动物细胞分离培养室用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，人们借以观察细胞的生长、增殖和细胞分化以及细胞凋亡或死 亡的过程。因为分离的细胞没有免疫防御系统，所以动物细胞分离操作需要比外科手术更加 严格的无菌操作，无菌操作的原则就是保证细胞分离过程中的操作环境，使用的器械、耗材以及试剂无菌。

1)硬件准备

①仪器：超净工作台、离心机、倒置显微镜、培养箱、冰箱、高压蒸汽消毒装置、移液器。

②器械：止血钳、手术刀、眼科剪、手术剪、镊子，细胞过滤筛等。所有器械清洗完以后，使用棉布包裹，捆好后湿热灭菌。

③耗材：培养皿、培养瓶、离心管(15 mL和50 mL)、巴氏吸管(或玻璃吸管)、移液管、烧杯。如果购买的是无菌包装的一次性耗材可以直接使用，如果是玻璃材质的用品，建议使用高压蒸汽灭菌。

④试剂：75％的酒精、碘酒、O．9％的生理盐水、DBSS、胰蛋白酶、DMEM(或PRMI-1640)液体培养基、抗血凝剂、血清、二甲基亚砜(DMSO)。所使用的液体溶剂大部分使用过滤除菌的方式保证无菌。培养基在使用前先在37℃水浴中升温。酶储液放置于一20℃，稀释以后放在4 ℃中保存，因胰蛋白酶在37 ℃中降解比较快，所以不建议酶升温至37℃再使用，可以直接从4℃中取出用完后尽快放回冰箱。因为动物组织比较珍贵，建议试剂在使用前先测试是否染菌。

⑤其他：冰块、脱脂棉球、封口膜、记号笔。

2)实验室的清洁

实验室一般采用照射或者熏蒸的方法消毒。熏蒸常使用过氧乙酸蒸气进行熏蒸，在动物细胞的体外培养中较少使用，一般使用紫外照射的方法灭菌。实验室在使用前半个小时打开紫外灯照射，虽然照射也可以对操作桌面灭菌，但因为紫外线容易被桌面上放置的物品挡住，导致桌面的灭菌受到影响，所以如有需要可以在使用前先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3％。来苏尔或0．1％新洁尔灭或O．5％过氧乙酸擦拭。紫外照射的时候也可以预先将实验中用到的物品放到实验台的边缘，进一步降低实验中可能存在的污染风险，照射前检查实验中所需要的物品是否已经准备妥当(如检查酒精灯中的酒精量是否可以保证实验的完成)，避免实验进行中因为缺少试剂或器械而导致实验被迫终止。

实验人员无菌操作前需要用肥皂清洗双手及手臂，用清水冲干净，穿好灭菌工作服，戴好口罩和帽子，进行操作前用75％的酒精擦洗双手，如戴乳胶手套，乳胶手套也要擦拭75％的酒情。可以将消毒用的酒精装到一个喷壶里面，这样保证酒精喷洒均匀；也可以将脱脂棉球放到装有酒精的广13瓶中，使用时用镊子取出棉球擦拭手和乳胶手套。

在超净台里面进行无菌操作时，所使用的试剂和器材在使用前应用火焰灼烧，如培养瓶的打开和拧紧的操作，一般使用酒精灯火焰灼烧。一般使用的金属器械不能进行长时间灼饶，避免损伤器械，导致生锈；金属器械要等到冷却以后再取动物组织。吸取过培养基和血清的耗材不能在火焰上加热太长时间，避免其中的蛋白等物质受热产生有害物质，从而影响细胞的生长。

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