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有效的定制多克隆抗体！PhosphoSolutions将在制作和测试您的定制多克隆抗体的整个过程中与您同在。Michael Browning 博士在设计和生产磷酸化特异性抗体方面拥有超过三十年的经验，负责 PhosphoSolutions 免疫肽的设计。此外，我们还是多克隆磷酸化抗体纯化和表征方面的专家。我们所做的不仅仅是从您的兔子身上收集和发送血清。我们自己筛选血清，寻找最高滴度的出血。然后我们在用免疫肽制成的亲和柱上纯化抗体，并在 ELISA 中表征抗体以检查磷酸化特异性。在您收到用于测试的抗体后，我们将继续与您合作以优化您的信号并取得成功。肽设计定制抗体开发的关键第一步是肽设计。抗体的特异性和效用主要取决于免疫肽。作为肽设计过程的一个例子，请考虑下图，说明酪氨酸羟化酶中丝氨酸 40 的磷酸肽。磷酸丝氨酸的 N 端和 C 端序列显示在图的中间，而肽设计显示在底部。设计该肽的基本原理如下：截短的 N 端序列：首先，肽具有截短的 N 端序列。这样做是为了消除与 Blast 搜索中鉴定的同源蛋白质的交叉反应。短序列的使用：第二，肽设计的另一个特点是使用非常短的序列，它迫使磷酸丝氨酰残基进入抗体识别的表位。C-末端的酰胺化：第三，鉴于肽的非常有利的两亲特性，C-末端被酰胺化以更好地模拟天然酪氨酸羟化酶蛋白。这种修饰可以提高蛋白质印迹中的免疫反应性，尤其是在免疫组织化学应用中。添加N 端半胱氨酰残基：最后，添加 N 端半胱氨酰残基以与载体蛋白结合并与亲和柱偶联。抗体纯化三种抗体可能性：用磷酸肽免疫后，兔子的免疫反应中可以产生三种抗体。如下图 1 所示，第一个是所需的磷酸化特异性抗体。然而，如果兔中的磷酸酶使注射的肽缀合物去磷酸化，也可以产生对肽的去磷酸形式特异的抗体。最后，可以针对不涉及表位中的磷酰基的肽的序列/构象产生泛特异性抗体。无论蛋白质的磷酸化状态如何，这些抗体都会与蛋白质发生反应。分离所需磷酸化特异性抗体的唯一方法是通过连续的磷酸化和去磷酸化层析。图1磷酸化特异性抗体的分离：我们使用的第一列是磷酸肽亲和柱（见图 2）。我们首先从血清中制备 IgG 级分，并将其应用于我们的磷酸肽亲和柱。我们之前描述的三种抗体中的两种将与此列结合。首先，磷酸化特异性抗体（蓝色）将结合，因为该柱上存在磷酸肽。泛特异性抗体（红色）也将结合，因为它识别的肽序列也存在于该列上。不会与该色谱柱结合的一种抗体是对肽的脱磷形式（绿色）具有特异性的抗体，因为该形式的肽不存在于色谱柱上。这些后面的抗体在流通中通过柱子，连同从兔血清中分离的额外 IgG 的完整补充。保存这些“流通”抗体，然后从磷酸肽亲和柱上洗脱磷酸化和泛特异性抗体。图2然后将洗脱的磷酸和泛特异性抗体应用于去磷酸肽亲和柱。只有泛特异性抗体与该柱结合，因为存在泛特异性肽序列而不是磷酸肽。磷酸化特异性抗体不会与色谱柱结合，而是在流通液中（见图 3）。虽然流出液含有所需的磷酸化特异性抗体并被保存，但泛特异性抗体可以被洗脱并保存（如果它们存在）。图 3Western 和 IHC 中的表征蛋白质印迹的特异性下面图 1 中的复合蛋白质印迹显示了我们突触蛋白泛抗体的特征双联体以及我们的三个磷酸化突触蛋白抗体，并展示了抗体特异性的两个非常重要的方面。首先，大鼠脑匀浆中没有抗体标记的交叉反应带。其次，通过将未经处理的大鼠脑匀浆（左）与相同的匀浆（但在凝胶上运行之前已用 lambda 和碱性磷酸酶处理过）（右）中的信号进行比较，明确证明了磷酸化特异性。磷酸酶处理对泛抗体的信号没有影响，但完全消除了磷酸化抗体的免疫标记。图1免疫组化现在我们转向免疫组织化学。我们的许多抗体都经过 IHC 测试。下面的图 2 显示了用绿色抗突触蛋白泛抗体染色培养的神经元（左）和用抗突触蛋白 Ser 549（右）染色的 C57 小鼠纹状体细胞。图2下面的图 3 说明了我们的 pan-TH 抗体在这张视网膜显微照片中的广泛标记（左）。相比之下，在这个光刺激的视网膜示例（右）中，磷酸化 TH 抗体仅选择性标记两个无长突细胞。图 3