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question 细胞裂解后液体粘稠 无法取上清 怎么办？
hela细胞，消化收集后保存在-80度，今天拿来裂解，发现裂解后溶液粘稠，根本没有办法取上清，请教大家。

裂解液：PBS100ml
NP-40 1ml
脱氧胆酸钠500mg
SDS 100mg
4度保存，临用加入1%PMSF储液（10mM/L）

裂解方案：3*106个细胞，加入50ul裂解液，吹打均匀，冰水中孵30分钟；取出，用1ml蓝枪头抽5次，12000rpm，30min，4度离心。

裂解现象： 离心后EP管底有薄层白色物质，但整个液体非常粘稠，用移液枪一吸就会整体被吸起来，无法分离出上清。细胞裂解的资料都说，离心后取上清，保存起来备用，到底问题出在那里呢？

，
香山雪林 2004-06-29
  • 前几天提样品，用两种不同的裂解液提，遇到了楼主所说的现象用含尿素，CHAPS，DTT的裂解液（因为该配方实验室摸出来，未发表，见谅）提取时，溶液澄清，蛋白含量也很高用做ICAT的提取液提（主要是尿素，浓度比前者低，EDTA，SDS）时，出现楼主所说现象，想是核酸影响，便考虑用机械破碎法，先用力多次重复用细胞刮在培养皿表面将提取液涂抹开，刮较长时间后，发现提取液逐渐澄清，待提取物较清后收集裂解产物，测含量，蛋白量不输用含尿素，CHAPS，DTT的裂解液提取的蛋白推测可能用较强烈的机械法断裂核酸链效果较好。
  • 我也遇到过这种情况,问过一个老师.她告诉我把移液气的枪头剪掉一点,试了一下,有点效果,不知还有没有更好的半法.
  • 会不会是DNA的关系，如果裂解细胞目的不是获得目的基因的话，可以试加一点DNase.
  • 是核酸的原因。
  • 加DNA酶消化30分钟，再离心。
  • 尝试根据需要改变裂解液配方，换用裂解能力更强的裂解液，如尿素，CHAPS等，当然不知道你们没选用这种常规裂解液是否出于实验需要我做HELA，用强裂解液不家核酸酶（担心引入其他蛋白）从未出现过楼主所说情况，2D结果显示样品提得较纯，无核酸影响
  • 多谢大家展开引用happyhuihui wrote:尝试根据需要改变裂解液配方，换用裂解能力更强的裂解液，如尿素，CHAPS等，当然不知道你们没选用这种常规裂解液是否出于实验需要我做HELA，用强裂解液不家核酸酶（担心引入其他蛋白）从未出现过楼主所说情况，2D结果显示样品提得较纯，无核酸影响......我是刚接触WB，正在尝试各个环节的实验，我的目的是将肿瘤细胞中的一个蛋白裂解出来，做WB。不知道您所说的常规裂解液是指哪一个？用尿素之后是不是还需要脱尿素处理才能跑电泳？如果方便，能否提供您的强裂解液的配方呢？谢谢
  • 这主要还是核酸问题，我们试过两种方法，一是低温超声加振荡，另一是反复几次低温冻融，效果都可以，你可以试试，和裂解液没关系。
  • 加大离心的速度或时间后会好一些。
  • 前几天提样品，用两种不同的裂解液提，遇到了楼主所说的现象用含尿素，CHAPS，DTT的裂解液（因为该配方实验室摸出来，未发表，见谅）提取时，溶液澄清，蛋白含量也很高用做ICAT的提取液提（主要是尿素，浓度比前者低，EDTA，SDS）时，出现楼主所说现象，想是核酸影响，便考虑用机械破碎法，先用力多次重复用细胞刮在培养皿表面将提取液涂抹开，刮较长时间后，发现提取液逐渐澄清，待提取物较清后收集裂解产物，测含量，蛋白量不输用含尿素，CHAPS，DTT的裂解液提取的蛋白推测可能用较强烈的机械法断裂核酸链效果较好。
answer全部回答 （共 11 条）
  • 低温超声加振荡!!!
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