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可视化细胞器的内部有助于我们了解它们的分子机制和研究细胞异常。

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首先，什么是细胞器？细胞器是位于真核和原核细胞细胞质中的小型亚细胞结构，在更复杂的真核细胞中，细胞器通常被自己的膜包围。每个细胞器都为该细胞执行专门的功能，就像器官为身体所做的一样。

除了使用细胞器特异性蛋白质标记之外，我们还可以使用细胞器选择性染料来突出感兴趣的结构，从而帮助您研究这些特殊结构中的每一个。下面我们总结了如何在识别单个细胞器时充分利用染色（图 1）。

图 1. 动物细胞突出显示了一些可以用细胞器特异性染料染色的关键细胞器。

选择染料前的四个注意事项：

在讨论可用于不同细胞器的不同染料之前，我们必须首先考虑某些要点，以确保我们从染色中获得最佳结果。

1.考虑染料的膜通透性。

DAPI膜通透性低，适用于固定细胞染色。 Hoechst（如33342）具有较高的膜通透性，也可用于活细胞。

2.考虑您的荧光波长。

例如，如果您使用在绿色通道中发光的二抗在脂质膜上鉴定感兴趣的蛋白质，则最好选择在远光通道中发光的脂质染料红色通道。这样，您就可以避免它们相互干扰。

3.确定染料的浓度至关重要

o 低浓度不会提供强烈的可视化，而过高的浓度会对您的样品产生毒性。

4.准确了解染料的工作原理

像罗丹明这样的线粒体染料依赖于膜电位。它们只能应用于活细胞，使其成为分析健康和细胞活力的有用工具。溶酶体染料需要该细胞器的酸性环境才能正常工作。它们在活细胞中的效果也最好。

不同的细胞器使用不同的染料1。质膜和高尔基复合体

整个细胞被磷脂双层、质膜包围，并在细胞质内包含多个膜网络。质膜的选择性通透性和囊泡的形成对于控制细胞内环境和蛋白质在细胞内的运输至关重要。

重要的是，请考虑染料的膜通透性。膜可以用凝集素染色，凝集素是碳水化合物-识别并结合糖的某些部分的结合蛋白。

小麦胚芽凝集素 (WGA) 等凝集素会染色质膜，也会染色高尔基体，高尔基体是一种由许多膜囊和囊泡组成的细胞器，涉及细胞内蛋白质加工。两种结构均由磷脂双分子层形成，都可以使用凝集素染色。

请注意：一些凝集素对特定的糖脂和糖蛋白具有特异性。这在对多种细胞类型进行成像时非常有用。例如，凝集素IsoB4通过与基底膜结合特异性染色内皮细胞。

2． ER 和脂滴

内质网 (ER) 是另一个膜系统，与核膜相连并参与脂质和蛋白质的加工。 ER 的管状池和扁平片可占整个细胞体积的约 10%。它可分为粗糙的 ER（与核糖体相关并参与蛋白质生产）或平滑 ER（与核糖体无关并参与脂质代谢）。尼罗红等染料与脂滴结合并染色所有亲脂性膜，以及任何细胞内脂滴。然而，像这样的染料会显示出很多背景染色，因此请仔细优化以确保结果可靠。

请注意：在用脂质特异性染料染色之前用油酸处理细胞会诱导脂滴形成。这可以用作阳性对照来检查染色剂是否按预期起作用。

3.溶酶体

溶酶体被描述为细胞的消化系统；它们含有降解酶。为了维持这些酶的功能，溶酶体必须保持在酸性条件下（大约 pH 5），这与细胞质的中性 pH 值形成对比，这意味着它们需要从细胞质中主动运输质子。最好使用专门在酸性环境中工作并通过 pH 梯度累积到 t 中的细胞渗透性染料。溶酶体。

请注意：中性红等溶酶体染料需要该细胞器的酸性环境，在活细胞中效果最佳。一个技巧是先添加溶酶体染料，然后再固定细胞，这样可以在之后添加蛋白质特异性抗体。

4.线粒体

线粒体被认为是细胞的动力源。它们通过氧化磷酸化过程产生几乎 90% 的生存所需能量，并且还是细胞凋亡的关键参与者。它们有两个膜，利用质子梯度产生 ATP，并将其用作中间能量储存。这种膜电位可以使用线粒体染料，如罗丹明，这是一种分析活细胞健康和活力的有用工具。但是，它只能在固定前使用，因为膜电位会降低。

请注意：罗丹明有毒，会抑制线粒体功能。

5.微管

微管是一种结构形成细胞骨架的细胞的所有成分，以及肌动蛋白和中间丝。虽然不是严格意义上的细胞器，但微管对于理解控制细胞的基本过程很重要，并且在可视化整个细胞时也有帮助。它们可以使用微管蛋白染料来识别，这取决于特定的结合亲和力，可能会影响微管动力学并可能停止有丝分裂。

请注意：使用甲醇固定而不是多聚甲醛。这将避免干扰交联蛋白并产生质量更好的图像。

p >图 2. 使用 FIS1 和α微管蛋白抗体对 4% PFA 固定的 HepG2 细胞进行免疫荧光分析。绿色：FIS1 (10956-1-AP)；红色：Alpha 微管蛋白 (66031-1-Ig)请记住 t让您的染料生锈！

在您的研究中，使用染料和抗体染色是一种简单有效的可视化细胞器的方法。确保您彻底研究可用的不同选项，从而确保获得最佳成功机会！

有关一般染色技巧和多种免疫染色技术的更多信息，请查看有关优化 IF 实验的技术技巧。

p >图 3. 使用胰高血糖素和胰岛素抗体对 4% PFA 固定的人胰腺组织进行免疫荧光分析。绿色：胰高血糖素 (15954-1-AP)；红色：胰岛素 (66198-1-Ig)

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