德国ChromoTek公司GFP trap和booster实验操作说明！苏州蚂蚁淘生物，优势代理！_技术资料_蚂蚁淘生物-试剂-抗体-蛋白-抑制剂专业代理商！ --蚂蚁淘在线

收集细胞：以下以一个免疫沉淀反应使用~106-107的哺乳动物细胞（约一个10厘米培养皿）表达绿色荧光蛋白标记蛋白为例。收获贴壁细胞、吸出生长培养基、向培养皿中加入1毫升预冷的PBS，并刮取细胞。细胞转移到一个预冷却的管子，在500g+4 C时的离心3分钟并丢弃上清液。用冰的PBS洗两次轻轻重新悬浮细胞块的细胞团。洗涤后进入下一步：

Lysecells:（细胞裂解）

1、用移液器或使用注射器在200 l冰冷的裂解缓冲液重悬细胞颗粒。注意：在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂与1mMPMSF（用户自备）。对于核/染色质蛋白可采用以下方案：使用RIPA中加入1mg/mlDNase,2.5mMMgCl2（自备）.

2、每充分吹打10分钟，把管子放置在冰上30分钟。

3、细胞裂解液20.000xg+4 C离心10分钟。转移裂解产物到一个预冷管中。向裂解液中加入稀释缓冲液300ul。丢弃颗粒。

注意：此时细胞裂解液可以放在-80 C进行长期储存。

可选：向稀释缓冲中加入蛋白酶抑制剂与1mMPMSF（用户自备）。

Equilibratebeads（平衡beads）

4、振荡混匀GFP-Trap _Abeads，吸取25 lbead到500 l冰冷的稀释缓冲液中。离心2.500xg2分钟+4 C。丢弃上清液和重复洗2次。

Bindproteins（结合蛋白）

5.将步骤3得到的稀释的裂解液加入到步骤4得到的平衡的GFP-Trap _Abeads中。如果需要，保存50ul的稀释裂解液进行免疫印迹分析。4 C翻滚振荡1小时。

6.2.500xg+4 C离心2分钟。如果需要，保存50ul上清液进行免疫印迹分析。丢弃其余的上清液。

Washbeads（清洗beads）

7.在500 l冰冷稀释缓冲液中重悬GFP-Trap _Abeads。在2.500xg+4 C离心2分钟。丢弃上清液和重复洗2次。

optional:Increasesaltconcentrationinthesecondwashingstepupto500mM.

可选：在第二次洗的步骤中增加盐的浓度到500mM。

Eluteproteins（洗脱蛋白）

方案一：用于westernblot（所有含GFP荧光标记的重组蛋白都会进行本步定量和鉴定实验）

8.在100 l2xSDS-samplebuffer中重悬GFP-Trap _Abeads。

9.煮沸重悬的GFP-Trap _Abeads在95 C，10min条件下，把免疫复合物从绿色荧光蛋白中游离出来。GFP-Trap _Abeads能通过2.500xg在4 C离心2分钟进行收集，收集的产物上清液可以进行SDS PAGE。

方案二：用于westernblot（所有含GFP荧光标记的重组蛋白都会进行本步定量和鉴定实验）

10.替代步骤8和9的可选步骤：洗脱绑定的蛋白加入50 l0.2M甘氨酸pH值2.5(孵育时间：30秒,恒定混匀），随后离心。转移上清液到新管中，为了中和添加5 l1MTris（pH值10.4）。为了提高洗脱效率可以重复这一步。

方案三：如需进行检测GFP-融合酶的活性检测，无需洗脱单独，可以直接检测。

方案四：如要进行CHIP实验，主要用于含有GFP荧光的重组蛋白的蛋白质/DNA相互作用的实验。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。其中第一步细胞固定，染色质断裂不变，染色质免疫沉淀，则直接进入说明书的第5步，加入的是DNA-蛋白复合物，结合到GFP-Trap _Abeads。进入第6步，第7步，分离得到复合物；进入第10步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定；同普通的CHIP实验。

方案五：pulldown实验:体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。两个已知蛋白的相互作用：一个蛋白是GFP融合蛋白，另一个蛋白为FLAG标签的融合蛋白；在第5步，同时加入两者，其他步骤不变。进入第10步，得到洗脱的复合物；同时进行GFP和FLAG的westernblot实验。筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白：操作同免疫沉淀法，第10步，得到洗脱的复合物，然后进行后期质谱检测。

方案五：Co-IP实验:体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。采用免疫沉淀，对象蛋白为GFP-目的蛋白结合的融合蛋白，与之相结合的蛋白质Y也被沉淀下来，从而达到吸附蛋白质-蛋白质复合物的目的。沉淀下来的蛋白质复合物采用SDS-Page跑胶，westernblot进行鉴定，也可以选择用得到的样品利用质谱进行后续分析。

GFPBooster实验操作：

1.固定：接种于盖玻片的细胞用的3.7%甲醛（溶于PBS）固定，室温下10分钟。

2.用含有0.1%吐温20的PBS(PBST)清洗样品三次。

3.穿透：添加含0.5%的TritonX100（PBS）到样品并温育5分钟，室温下。或者通透细胞：在100%甲醇中温育样品5分钟（--20 C）。

4.用PBST清洗样品两次。

5.封闭：PBST中添加4%BSA加入到样品中，室温温育10分钟。

6.GFP-Booster温育：在blocking缓冲液中加入200倍稀释的GFP-Booster，室温温育1小时。

7.用PBST清洗样品三次，每次洗5-10min。8.如果需要的话，用DNA荧光染料染色（如DAPI）。

9.安装：在水中快速冲洗样品，以防止盐晶体的形成。按照盖玻片。经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。

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