细胞毒性测定基于 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5二苯基四唑溴化物）被活细胞转化为甲臜晶体。这种转化可用于确定线粒体活性。由于对于大多数细胞群而言，总线粒体活性与活细胞数量相关，因此该测定广泛用于测量药物对不同细胞系或原代细胞类型的体外细胞毒性作用。
A.试剂和制备试剂MTT 溶液：将500 mg MTT 粉末溶解在10 ml PBS 中。用磁力搅拌器搅拌约。黑暗中 1 小时。用 0.22 mm 过滤器过滤溶液，并在黑暗中以 10 ml 等分试样储存在 -20 °C 下。酸化异丙醇 – 将 50 ml 2 M HCl 添加到 2.5 l 异丙醇中。使用前将溶液在室温下储存至少 1 个月。该溶液用于溶解甲臜晶体。其他解决方案如因为甲醇、乙醇和 DMSO 也适用。注意：如果异丙醇未正确酸化，悬浮液会变得浑浊。设备 96 孔平底微孔板台式离心机微量滴定板读取器（例如，带 650 和 570 纳米过滤器）单通道移液器（0.001 – 1 毫升）多通道移液器（0.01 – 0.3 毫升）37°C 培养箱无菌移液器吸头层流罩（例如 2B 类）板设置每个板应包含控制孔（无药物）和空白孔（无细胞）。需要额外的控制孔与介质（没有细胞）包括药物的范围，如果药物在给定波长处显示吸光度。将样品、对照和空白作为一式两份或一式三份进行培养，以最大限度地减少结果变异性。标准的 MTT 测定需要：一个用于测量药物 OD 的测试板，一个用于确定每孔接种细胞起始量的生长曲线的测试板，以及一个用于确定实验稀释范围的宽稀释范围。注意：对于使用患者样本的标准化 MTT 药物敏感性测定，通常一块板就足够了。对于细胞系，还建议包括一个第 0 天的板，用于确定整个实验过程中细胞生长的程度。不要使用板的外孔（由于蒸发）。用 PBS 填充外孔以尽量减少板蒸发。一些药物也会对相邻的孔产生影响 - 这应该在开始实验之前进行调查。B。程序如果药物的稳定性未知，应按照步骤 1-3 新鲜制备板：
向每个孔中加入 30 µl 药物浓度/稀释原液，不包括对照孔。添加 ~120将微升细胞（1000-100000 个细胞）加入每个孔中，空白除外。所用细胞的最佳浓度取决于细胞系/类型。细胞和药物悬浮液的总体积应为每孔 150 µl，不包括空白和对照。注意：对于可在 -20 ° 下储存的稳定药物C、p可以用 30 µl 药物浓度配制乳胶液，并储存在 -20°C 下以备后用。运行测定时，可以添加细胞并与药物悬浮液混合。根据使用的细胞系/类型，在 37 °C 下用 5% CO2 孵育板 72-96 小时。适当的孵育时间后，添加 5每口井加入 mg/mL（1:10 体积）的 MTT 溶液。未使用的 MTT 可在 −20 °C 下冷冻并重复使用。通过缓慢增加摇动速度至每分钟最多 900 次，在平板振荡器上摇动平板 5 分钟。将平板在 37°C 下孵育 4-6 小时二氧化碳培养箱。注意：孵育时间取决于细胞类型。向每个孔中加入 150 µl 酸化异丙醇（或替代试剂），并重新悬浮直至所有 Formazan 晶体溶解。使用多道移液器彻底混合每个孔。在每一行之间，用异丙醇冲洗多通道移液器的吸头并丢弃用过的异丙醇。在混合下一行之前彻底吹出提示。以 t 开头在将各行与药物混合之前，他控制孔。在记录吸光度测量值之前，让板在室温下在黑暗中静置至少 10 分钟。光密度 (OD) 测量
在 540 和 720 nm 处测量 OD，以通过校正背景噪声获得更精确的测量结果。从 540 nm OD 总信号中减去 720 nm OD 背景。要计算活细胞的百分比，请使用以下公式：
控制孔（细胞，无药物）：（控制孔的平均 OD）-（空白孔的平均 OD）药物孔（含有细胞）：（平均药物孔的 OD）-（空白孔的平均 OD）如果药物干扰 OD 测量：（对照孔的平均 OD）-（药物孔的平均 OD（药物，无细胞））。然后计算细胞存活率通过：（处理良好的 OD [-空白]）/（平均 OD 控制良好 [-空白]）× 100。然后可以计算 LC50，或导致 50% 细胞存活的药物浓度。为获得更可靠的结果，实验应一式两份或一式三份进行。>>> 更多资讯详情请访问蚂蚁淘商城
