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StressMarq细胞培养测定

以下协议用于生成用1型和2型alpha突触核蛋白预制原纤维（PFF）处理的神经元的ICC图像。当用1型α突触核蛋白PFFs治疗时，原代大鼠海马神经元显示出路易体包涵体形成，而当使用2型α突触核蛋白PFFs治疗时则没有。

1. 从出生后第1天的Sprague Dawley大鼠幼仔中收获海马神经元，并以每孔80,000个细胞的平板接种在聚D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的平板上。

2. 在处理之前，将预制的原纤维在水浴超声仪中超声处理1小时。

3. 用预制的原纤维以4 µg / mL处理神经元。维护有车辆的对照井。

4. 7天后，所有孔均进行了50％的培养基更换。

5. 更换培养基后7天（处理后体外第14天），所有孔均用4％甲醛固定20分钟。

6. 用过滤的10 mM磷酸盐缓冲盐水洗涤三次（每次10分钟），以洗去甲醛。

7. 然后将细胞用1：1 PBS：LiCOR Odyssey Block（LiCOR，927-40010）和30 mL / mL的0.1％triton-X 100封闭30分钟。

8. 30分钟后，将在1：1 PBS：LiCOR Odyssey Block（含30 mL / mL的0.1％triton-X 100）中稀释的第一抗体添加至孔中，并于4度孵育过夜。

9. 第二天，用三遍过滤的10 mM磷酸盐缓冲盐水洗涤每次抗体溶液（每次10分钟）。

10. 将二抗稀释在1：1 PBS：LiCOR Odyssey Block（含30 mL / mL的0.1％triton-X 100）中，并在黑暗中加入孔中60分钟。

11. 60分钟后，用三遍过滤的10 mM磷酸盐缓冲盐水洗涤洗出二级抗体溶液（每次10分钟）。

12. 然后将板在落射荧光显微镜（Olympus IX73，B＆B Microscopes）上以20倍物镜成像。

13. 以相同的固定比例和相同的曝光时间捕获所有图像。