Harrop, R. 等人。 （2008）。结直肠癌患者在化疗（5-氟尿嘧啶、亚叶酸和伊立替康）的同时接种 TroVax® 疫苗是安全的，并且会诱导有效的免疫反应。癌症免疫学 免疫治疗。 57（7）：977-86。 [PubMedID: 18060404]

Oxford BioMedica 的科学家使用 ProImmune 的 PEPscreen® 肽和 ProVE® MHC 五聚体在 TroVax® 给药后检测患者样本中的新型 T 细胞表位。他们使用 ProVE® 五聚体证实了所识别的 T 细胞表位的 MHC 限制，并证明 T 细胞确实具有抗原特异性。

TroVax® 由编码肿瘤相关抗原的重组痘苗病毒 (MVA) 组成。抗原 5T4，在正常组织中很少检测到，但在多种实体瘤中高水平表达。介绍5T4 抗原的存在与不良预后相关。

在 Oxford BioMedica 的结直肠癌 I/II 期试验中，94% 的患者对 TroVax® 抗原有反应。研究发现免疫反应的强度与疾病进展的时间之间呈正相关。基于这些信息，进一步详细分析 TroVax® 诱导的 5T4 特异性 T 细胞反应对于 Oxford BioMedica 来说非常重要。特别是，研究人员希望了解这些免疫反应的程度、特异性和表型。

随后两项针对转移性结直肠癌的 II 期研究重申了早期 I/II 期中观察到的高频率反应。在这些研究的免疫学分析中，Oxford BioMedica 在 IFN-gamma ELISPOT 测定中使用了 ProImmune PEPscreen® 9mer 肽库，开始验证早期 MHC 肽结合研究中涉及的 5T4 表位。这确定了未检测到 5T4 的患者- 治疗前有特定的细胞反应，但在 TroVax® 疫苗接种后出现非常强烈的反应（图 1）。然而，IFN-gamma ELISPOT 检测显示了肽刺激后分泌 IFN-gamma 的细胞的频率，但没有揭示其表型。

为了确认患有以下疾病的患者的免疫反应的性质：接受 TroVax® 治疗后，Oxford BioMedica 希望确定这些患者中是否存在增加的抗原特异性 T 细胞群。他们再次求助于 ProImmune 来快速合成 ProVE® MHC 五聚体库。 ProVE® 五聚体可以快速、经济地生成，用于在流式细胞术中检测单个抗原特异性 T 细胞，并能够对新 T 细胞表位进行最终验证。

ProImmune 提供了 10 种 5T4 特异性 ProVE® MHC 五聚体用于验证 IFN-gamma ELISPOT 检测到的反应并确认 5T4 T 细胞表位的 MHC 限制（图 2）。预对于相同的肽抗原，使用 ProVE® MHC 五聚体检测到的光标频率大约是使用 IFN-gamma ELISPOT 检测检测到的光标频率的 2 倍，表明这两种检测之间具有良好的相关性。

图 1：患者总共接受了 6 次肌肉注射 TroVax® 疫苗接种：化疗前 2 次、化疗期间 2 次、化疗后 2 次。在初次接种疫苗之前和化疗完成后两周采集血样。 96 孔培养板涂有抗 IFN-γ 抗体 (1-D1K)。每孔铺板 200,000 个 PBMC，并在 37°C 下与 5μg/ml 肽一起孵育过夜。去除细胞并洗涤板，然后添加生物素化的抗-IFN-γ检测抗体(7-B6-1)。添加链霉亲和素-ALP，然后添加沉淀素g ALP 底物，形成斑点并进行计数。该图显示了单个患者的结果。治疗前，平均每 200,000 个细胞可检测到一个斑点。然而，在化疗和 TroVax® 治疗相结合后，平均每 200,000 人中可检测到 93 个斑点，表明对 5T4 特异性肽产生了强烈反应。

< img解码=\"async”loading=\"lazy”src=\"https://www.proimmune.com/wp-content/uploads/2023/07/trovax.jpg”alt=\"流式细胞术结果示例”width=\"588” \" height=\"238\" border=\"0\">

图 2：在初次疫苗接种前和化疗完成后 2 周采集患者血样。对于流式细胞术染色，将 2 x 106 PBMC 与 1 份测试 (0.5 µg) ProVE® 五聚体在室温下孵育 10 分钟，然后加入 1 份测试 R-PE 标记的 Pro5® Fluorotag 和 1 份测试 FITC 标记的抗 CD8 抗体（克隆 RPA-T8）4°C 20 分钟。通过流式分析样品收集细胞计数和 500,000 个现场事件。同一患者的结果如图 1 所示。在使用 A*02:01 限制性 ProVE® 五聚体完成化疗后采集的样本中检测到了清晰的 5T4 特异性 CD8+ T 细胞群（C：0.22%）活门）。在使用 TroVax® (B) 疫苗接种之前，此类抗原特异性细胞并不存在。当使用 A*01:01 限制性 ProVE® 五聚体（阴性五聚体）进行染色 (A) 时，在任一时间点均未检测到抗原特异性细胞。

注射 TroVax® 疫苗可明显引发识别 5T4 特定表位的抗原特异性 T 淋巴细胞的扩增证明了所研究患者体内的有效细胞免疫反应。 ProVE® MHC 五聚体提供了一种强大的方法来阐明接受免疫治疗的患者细胞免疫反应的详细概况。正如本研究所示，可以清楚地确定对单个表位的 CTL 反应，从而证实了 ProVE 的适用性® MHC 五聚体在新型免疫疗法临床开发中的应用。

PEPscreen® 由 Sigma（前身为 Sigma-Genosys）为 ProImmune 制造PEPscreen 是 Sigma 的注册商标-Aldrich Biotechnology LP 和 Sigma-Aldrich Co.

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