小中大【求助】250KD蛋白WB问题各位大侠：本人在做250KD蛋白WB时出现如下图现象，封闭过夜，一抗按说明书稀释1000倍，二抗也是1000倍，加入ECL后可见膜上大量荧光，曝光5s就一大片黑。查论坛说可能是抗体浓度过高，就都稀释到2000倍，可效果也不是很理想，而且人家说明书上就说是1000倍就OK了，到底是哪里出了问题啊？例外，我们实验室是半干转，这么大的分子量转移条件应该是多少比较好哦？？迷茫中，麻烦解惑啊！深表感谢！附件2014-1-19 10:48 63979861.snap.jpg (13.61 KB) ritou1985[使用道具]四级UID 77664精华 0积分 644帖子 948信誉分 100 可用分 5596 专家分 0 阅读权限 255注册 2011-11-19状态 离线小中大大分子量的western blot相对难做一些，首先你的分离胶浓度5%或者6%就可以了，转膜的时间要久一些，转移的时间可以适当的延长到90-120min；封闭的时间要长，如果是用5%脱脂牛奶封闭的话，可以提高牛奶的浓度，但是不能太高，太高的话会把结合位点全部封闭，你需要自己摸索一下，我自己觉得7%-8%还可以，你可以试一下；同时要降低一抗的浓度，你可以摸索一下以抗的浓度，做个梯度是最好的，如果觉得麻烦的话，可以先直接稀释到1：1万；二抗的浓度有时候影响不是很大，如果背景很高的话，你可以适当的降低二抗的浓度；加入ECL后如果很亮，曝光时间尽量短，显影要快，一旦看见条带马上终止显影，自来水冲一下马上放入定影液，希望对你有帮助。 tangxin_80[使用道具]四级UID 79896精华 0积分 549帖子 757信誉分 100 可用分 4621 专家分 0 阅读权限 255注册 2011-12-17状态 离线小中大你好，我也正在做一个分子量为265kd的蛋白，一次都没有结果，你跑的分离胶多大浓度？我用的6%的胶，每次转膜完了压根看不到Marker条带，胶上膜上都看不到，所以不知道转膜该用什么条件，考染有时候看的到250kd上方有条带，有时候又看不到，郁闷啊，也许咱们可以交流一下 bangqi_k[使用道具]三级UID 114509精华 0积分 254帖子 247信誉分 100 可用分 1967 专家分 0 阅读权限 255注册 2013-9-25状态 离线小中大我采用半干法转膜，考虑到怕易烂，用的8%的分离胶，前天转膜6h效果还是不好，立春红染色感觉好像没有转过去，今天准备过夜转，不知道会不会烧坏仪器。准备转过去之后，再进一步优化封闭和抗体条件。 bangqi_k[使用道具]三级UID 114509精华 0积分 254帖子 247信誉分 100 可用分 1967 专家分 0 阅读权限 255注册 2013-9-25状态 离线小中大我采用半干法转膜，考虑到怕易烂，用的8%的分离胶，前天转膜6h效果还是不好，立春红染色感觉好像没有转过去，今天准备过夜转，不知道会不会烧坏仪器。准备转过去之后，再进一步优化封闭和抗体条件。 zbboom[使用道具]三级UID 114497精华 0积分 340帖子 360信誉分 100 可用分 2600 专家分 0 阅读权限 255注册 2013-9-25状态 离线小中大楼上的，我也做的250KD左右的，结束了。实验是比较难出一次很好的，重复性不是很高。分离胶7%-8%就可以了，低了不好。胶脆的很。浓缩胶4%。Marker建议用国外的，刚开始用的2个国内的都不好，强烈推荐2个国外大分子Marker，伯乐的10-250的，fermentas的20-250的，2个都不错。我用的前面的伯乐的很好，80/120v电泳等250到中间停，半干转2h，15V.一抗也必须国外的，效价很好，我们用的以色列的alomone，推荐1：200，我稀释到1：1000都没什么问题。国内的2抗1：10000。洗膜时间要充分。 bangqi_k[使用道具]三级UID 114509精华 0积分 254帖子 247信誉分 100 可用分 1967 专家分 0 阅读权限 255注册 2013-9-25状态 离线小中大QUOTE:原帖由 zbboom 于 2014-1-19 10:50 发表 bbcodeurl(\'http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif\', \'%s\')楼上的，我也做的250KD左右的，结束了。实验是比较难出一次很好的，重复性不是很高。分离胶7%-8%就可以了，低了不好。胶脆的很。浓缩胶4%。Marker建议用国外的，刚开始用的2个国内的都不好，强烈推荐2个国外大分子Marker，伯乐的1 ... 15v，2h能转过去吗？我的20v，6h好像都没有很好的效果，我用的是biorad的半干转仪 zbboom[使用道具]三级UID 114497精华 0积分 340帖子 360信誉分 100 可用分 2600 专家分 0 阅读权限 255注册 2013-9-25状态 离线小中大QUOTE:原帖由 zbboom 于 2014-1-19 10:51 发表 bbcodeurl(\'http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif\', \'%s\')晕死，超过2h会烧坏机子的，你没看说明书么？、只要转膜液没问题，肯定能转过去的了，我一般1h45min就停了。。最好湿转，但是我湿转了3次都失败了，就坚持半干，也没大问题的 ... 哦？这样哦！呵呵见笑了，机子是实验室以前买的，说明书早不见了，我的转移buffer:SDS0.1%,甲醇10%可以吗？

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