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概述

Golden Gate Assembly of 35 fragments using BsmBI- v2 限制酶与 T4 DNA 连接酶，随后转化为 NEB 10-beta CompetentE。大肠杆菌（高效）。

材料

NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) (NEB #E1602)pGGAselect Destination Plasmid*NEB 10-beta CompetentE.大肠杆菌(NEB #C3019)NEB 10-beta/稳定生长培养基 (NEB #B9035)LB 琼脂平板与氯霉素*包含在 NEBridge® 金门组装套件 (BsmBI-v2) (NEB #E1602)

反应设置

如下设置组装反应：

REAGENTASSEMBLY REACTION pGGAselectDestination Plasmid(1)*, 75 ng/μl1 μl Amplicon Inserts(2)3 nM(3)each amplicon (final concentration)T4 DNA连接酶缓冲液 (NEB #B0202) (10X)2 μl NEBridge® 金门酶试剂盒 (BsmBI-v2) (NEB #E1602)2 μl 无核酸酶 H2O (NEB #B1500) 至 20 μl(4)

* 或用户提供

(1) 目的载体必须在插入序列的两端和正确的方向上具有 BsmBI 限制性位点。(2) 扩增子插入必须具有 5 个侧翼碱基（推荐 6 个）和 BsmBI 限制性位点(3) NEBiocalculator®Tool (nebiocalculator.neb.com) 可用于摩尔浓度计算。(4) 由于 DNA 组分体积的原因，如果需要，可增加至 25 μl 体积;添加额外的 0.5 μl T4 DNA 连接酶缓冲液 (10X)。反应组装方案 建议组装方案（42°C，5 分钟→16°C，5 分钟）x 30(5)→60°C，5 分钟→4°C（ 6) (5) 额外的循环可能会提高装配产量。(6) 在转化前将反应冷却至 4°C，或将完成的装配反应储存在 -20°C。

转化

对于每个装配，解冻一个50 µl NEB 10-beta 感受态大肠杆菌管在冰上放置 5-10 分钟。添加 2 µl 组装反应液；轻弹试管 4-5 次轻轻混合。在冰上孵育 30 分钟。在 42°C 下热激 30 秒。放回冰上 5 分钟。添加 950 µl 室温 NEB 10-beta/稳定生长培养基（NEB #B9035）。在 37°C 下孵育 60 分钟，剧烈摇动 (250 rpm) 或使用旋转装置。

接种

含有氯霉素（用于 pGGAselect）的 LB 琼脂平板在 37°C 下加热 15 分钟。混合轻弹试管并倒置以彻底清除细胞，然后将 100 µl 生长物涂到每个平板上。将平板在 37°C 下孵育过夜，或在 30°C 下孵育 24 小时，或在 25°C 下孵育 48 小时。图 1：高容量金门用 T4 DNA 连接酶和 BsmBI-v2 组装。(A) 35 片段 lac 操纵子盒测试系统示意图 (B) 组装反应的结果。进行了四次重复实验，以量化每 50 μL 大肠杆菌生长（0.1 μL 的组装反应）中含有正确和不正确组装产物的菌落形成单位的数量。平均而言，71% 的观察到的转化体含有正确组装的产物。 (C) 具有蓝色和白色菌落的代表性琼脂板。蓝色转化体含有正确的组装结构，白色转化体含有不准确的组装产物。 Pryor, J. M. 等人。 (2020) PLoS One，https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238592

参考

NEBridge™ Golden Gate Assembly ToolLigase Fidelity ToolsGolden Gate Assembly Resource PageWebinar: Fidelity和末端连接连接中的偏差：启用复杂的多片段 Golden Gate DNA AssemblyPryor，J. M. 等。 (2020) PLoS One，https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238592

此资源的链接应用：DNA 组装和克隆、高通量克隆和自动化解决方案相关产品cts:BsmBI-v2, NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2)视频+在构建高复杂度金门装配目标时听取DAD（数据优化装配设计）

该网络研讨会介绍了见解和修改Golden Gate Assembly 协议使 50 多个 DNA 片段能够在一次反应中忠实地组装。

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