脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）也来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。在Mgsuperscript2+superscript存在下，独立作用于每条DNA链，且切割位点随机。在Mnsuperscript2+superscript存在下。
它可在两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端或12个核苷酸突出的DNA片段。DNaseI用途广泛，如切口平移标记时在dsDNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口，以将分子截短（在亚硫酸氧盐介导的诱变前）；建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序；在DNA酶足迹法（DNA：footprinting）中分析蛋白—DNA复合物；除去RNA样品中的DNA。
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