核酸、抗体、多肽等这些生物药物，因其有着药效高、副作用小、作用目标明确等等特点，一直受到国内外研究者的关注。基因工程、蛋白质工程的发展，极大地促进了生物药物的研究与开发，使之成为医药研究领域的一个重要方面，并代表着医药产品发展的方向。而倚赖计算机技术和生物信息学技术的飞速发展，分子模拟已经被越来越多地应用于药物设计研究当中，这一技术在化学药物研究中的应用相对已非常成熟，那么在生物药物研究过程中，我们又该如何应用分子模拟技术来辅助实现一定的研究目的呢？

图1 生物药物的分类

Discovery Studio™（简称DS），基于Windows/Linux系统，面向生命科学领域的新一代分子建模和模拟环境。通过高质量的图形界面、经多年验证的科学算法以及集成的环境，为科学家提供易用的蛋白质模拟和药物设计工具。DS服务于生命科学领域的实验生物学家、药物化学家、结构生物学家、计算生物学家和计算化学家等，应用于蛋白质结构功能研究，以及药物发现。在生物制药领域，DS能够针对核酸、抗体、多肽这三种生物药物研究体系为国内广大致力于生物药物研发的科研工作者提供一系列合理高效的解决方案。

· Discovery Studio在抗体药物领域的应用

抗体分子是生物学和医学领域用途最为广泛的蛋白分子，广泛应用于疾病诊断、治疗及科学研究等领域。抗体类药物以其高特异性、有效性和安全性正在发展成为国际药品市场上一大类新型诊断和治疗剂。

图2 抗体药物的研究方向

· Discovery Studio在抗体药物研究领域可提供的解决方案：

□ 抗体序列的注释与分析 · 重链可变区、恒定区、CDR Loop区的识别 · 轻链可变区、恒定区、CDR Loop区的识别 · Gemline基因的识别 · 抗原表位的预测 · 翻译后修饰位点的预测

□ 构建抗体结构 · 抗体Fab区模建 · 抗体全长模建 · 抗体CDR Loop区的模建 · 抗体人源化模建

□ 预测抗体-抗原（半抗原）相互作用 · 抗原（半抗原）- 抗体结合模式预测 · 分子动力学稳定上述复合物结构 · 抗原（半抗原）- 抗体亲和能力强弱预测 ·抗体表面电荷分布计算

□ 改造抗体结构 · 虚拟氨基酸突变设计稳定性更好的抗体 · 虚拟氨基酸突变设计与抗原亲和能力更高的抗体 · 预测影响抗体聚集的氨基酸位点 · 批量预测抗体的聚集效应 · 预测并引入二硫键已提高抗体的稳定性 · 分子动力学的精确计算

· 案例分析一、利用同源建模和蛋白对接确定抗原表位^[1]

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)是我国2010年新发现的新布尼亚病毒,可导致人类严重发热伴血小板减少综合征。为了更好的控制SFTSV的传染，需要对人体在布尼亚病毒感染免疫反应中的抗原靶标有更好的了解。实验表明SFTSV病毒的核衣壳蛋白是SFTSV免疫反应中单抗的主要识别反应蛋白。

思路：

本文作者首先通过DS_MODELER对SFTSV病毒的核衣壳蛋白进行同源建模，并利用DS_CHARMm对结构进行优化；然后采用DS_ZDOCK将其与抗体分子进行对接，发现了四个区域（图7）可能是SFTSV病毒核衣壳蛋白的抗原表位；接着采用定点突变的方法对这四个区域进行了验证。（表1）

图3 实验思路示意图

图4 抗原表位域预测结果，其中黄色部分为可能的抗原表面区域

· 案例分析二、利用分子模拟技术辅助鼠源抗体的人源化改造^[2]

多年的研究表明，鼠源性抗体在人体可诱发人抗鼠抗体反应，在临床应用一般效果不佳。研制人源化抗体可以降低抗体药物在人体的免疫原性；与鼠源性抗体相比，还可提高效应功能。人源化抗体含嵌合抗体、改型抗体和表面重塑抗体。

思路：

本文应用分子模拟技术辅助抗体表面重塑，研究对象为鼠源单克隆抗体m357，它能够和人体肿瘤坏死因子作用，起到抗肿瘤的作用，首先应用DS_MODELER模建了m357可变区的三维结构（图8），并应用DS_CHARMm进行能量优化，然后在该结构模型基础上计算表面残基的溶剂可极化表面积，识别活性残基，通过序列比对预测可变区保守及非保守残基（图9），其中CDR区及其周围5埃范围内非保守残基仍保留鼠源，然后利用实验方法将其余非保守残基人源化，得到的单克隆抗体h357，经多种方法进行生物活性测定，其完全保留了鼠源抗体的活性，临床研究正在进行。

图5 DS_MODELER 模拟m357可变区(Fv)三维结构，红色部分为互补决定区(CDRs)

图6 人源与鼠源抗体可变区序列比对结果

· Discovery Studio在多肽药物领域的应用

图7 多肽药物研究方向

· Discovery Studio在多肽药物研究领域可提供的解决方案：

□ 多肽结构的构建与优化 · 多肽结构从头构建 · 多肽结构同源建模 · 多肽结构的分子力学/分子动力学优化

□ 多肽-靶标作用机理解释 · 多肽与靶标结合模式的预测 · 分子动力学稳定上述复合物结构 · 多肽与靶标亲和能力强弱的预测

□ 改造多肽结构 · 虚拟氨基酸突变提高多肽与靶标的亲和力 · 分子动力学的精确计算

· 案例分析一、ACE多肽抑制剂作用机理的研究^[3]

血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是一种锌离子依赖型羧二肽酶，可以催化水解十肽血管紧张素I 羧基末端两个氨基酸，生成具有血管收缩作用的八肽血管紧张素II，在血压调节系统renin - angiotensin system (RAS 系统)中具有重要作用，其抑制剂已成功地作为治疗高血压的一线药物应用于临床。

思路：

作者通过实验的方法确定了ACE抑制剂成分为LL二肽。利用DSV（Discovery Studio Visualizer）从头构建出LL二肽结构并基于分子力学对其构象进行优化，然后将优化之后的LL同ACE进行柔性的分子对接DS_Flexible Docking（图12），从分子水平分析LL具体的作用机制，此外还基于DS_CHARMm计算分析了ACE同LL（LeuLeu）的相互作用能，从能量角度分析关键作用残基及每个残基对作用能的不同贡献。

图8 实验思路示意图

图9 左上图，整体结合模式；右上图，局部结合模式；左下图，疏水作用，蓝色为疏水残基，黄色为亲水残基；右下图，氢键作用

· 案例分析二、登革病毒NS2B-NS3蛋白的多肽抑制剂研究^[4]

登革病毒（ Dengue virus，DENV）属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。这些疾病广泛流行于热带和亚热带地区，是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病。 DENV依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型，其中2型传播最广泛。

思路：

本文作者在寻找2型DENV蛋白酶抑制剂的过程中，发现其中一种芋螺毒素MrIA针对DENV NS2B-NS3蛋白酶有抑制活性，而该抑制活性主要由一段含二硫键的loop区所介导（图13）。基于该段loop本文后续进行了一系列的合理优化，最终得到一个含八个氨基酸残基的环肽，并经实验证实其抑制活性、稳定性、特异性以及细胞通透性（图14）。此外本文采用分子模拟手段考察了该环肽同DENV NS2B-NS3蛋白酶的相互作用机制。首先采用DS_MODELER同源建模预测了DENV NS2B-NS3蛋白酶的三维结构；其次采用DSV工具栏构建了八环肽结构；然后采用DS_CDOCKER将八环肽对接至DENV NS2B-NS3蛋白酶的活性位点（图15）。

图10 HPLC测定谱图

图11 环肽的活性更高

图12 相互作用机理示意图

· Discovery Studio在核酸领域的应用

随着人们对核酸结构和功能认识的不断深入，核酸及其衍生物以其独特的作用与性能在药物、食品、环境等研究领域都得到了越来越多的关注与应用。特异性结合或裂解致病基因的核酸药物因其作用效率高，应用范围广，是对传统药物的补充，具有潜在的临床应用前景。

图13 核酸药物的研究方向

· Discovery Studio在核酸药物研究领域可提供的解决方案：

□ 核酸结构的预测和优化· 核酸结构的从头构建· 核酸结构的分子力学/分子动力学优化

□ 预测核酸-靶标相互作用· 核酸-靶标结合模式预测· 分子动力学稳定上述复合物结构· 核酸-靶标亲和能力强弱预测· 核酸表面电荷分布计算

□ 核酸疫苗的设计· 抗体结构的预测· 抗体-抗原相互作用的预测· 抗原的设计与优化

· 案例分析一、核酸适配体Aptamer同HIV1病毒中和机制的研究^[5]

HIV-1病毒的感染在很大程度上依赖于病毒表面的一种糖蛋白gp120。HIV-1 gp120参与了病毒入胞的过程，它以三聚体的形式附着在HIV-1病毒表面并通过与宿主细胞受体CD4结合等一系列过程介导病毒质膜与宿主细胞膜的融合从而导致病毒入胞。由77个核苷酸组成的核酸适配体B40t77可以与gp120高特异性结合从而阻止病毒入胞。

思路：

本文首先采用DSV（Discovery Studio Visualizer）构建了B40t77闭合型和开放型的三维结构模型，并基于DS_CHARMm进行了结构优化。接着将B40t77模型对接至gp120晶体结构（2B4C）得到复合物的三维结构，并对其作用模式进行了预测（图4）。发现抗gp120适体之所以可以阻止HIV-1的入胞过程是通过对CD4诱导的抗原表位产生了立体位阻效应并介导了构象的变化从而扰乱了在结合位点的结合。

图14 实验思路示意图(加静电表面的图形)

图15 B40t77-gp120作用模式的预测

· 参考文献

1、Li Yu, Li Zhang, Lina Sun, Jing Lu, Wei Wu, Chuan Li, Quanfu Zhang, Fushun Zhang, Cong Jin,Xianjun Wang, Zhenqiang Bi, Dexin Li, Mifang Liang. (2012). Critical Epitopes in the Nucleocapsid Protein of SFTS Virus Recognized by a Panel of SFTS Patients Derived Human Monoclonal Antibodies. PLoS One7, e38291.

2、W-C, C., Y-P, L. & M-Y, C. (2011). Humanization and Characterization of an Anti-Human TNF-aMurine Monoclonal Antibody. Plos One6, e16373.

3、Pan, D. D., Cao, J. X., Guo, H. Q. & Zhao, B. (2012). Studies on purification and the molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein hydrolysate. Food Chemistry130, 121-126.

4、Xu, S. Q., Li, H., Shao, X. X., Fan, C. X., Ericksen, B., Liu, J. S., Chi, C. W. & Wang, C. G. (2012). Critical Effect of Peptide Cyclization on the Potency of Peptide Inhibitors against Dengue Virus NS2B-NS3 Protease. Journal Of Medicinal Chemistry55, 6881-6887.

5、Joubert, M. K., Kinsley, N., Capovilla, A., Sewell, B. T., Jaffer, M. A. & Khati, M. (2010). A modeled structure of an aptamer-gp120 complex provides insight into the mechanism of HIV-1 neutralization. Biochemistry49, 5880-90.

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