小小的microRNA（miRNA）在近年来受到了越来越多的关注，因为它们能够在转录后调控基因表达。此外，由于miRNA相对稳定，并且可以在各种生物体液中发现，这些小分子也成为许多疾病的生物标志物，如癌症、神经系统疾病和免疫系统疾病。
miRNA通常是利用RT-qPCR和芯片来研究的，但西北大学NUSeq核心实验室的主任Xinkun Wang指出，这些技术只能分析已知的miRNA种类，不能探索新东西。\"有了miRNA测序（miRNA-Seq），你就可以发现一些新东西。”
尽管miRNA的测序在本质上与其他RNA相同，但样本处理时的一些步骤却是不同的。这篇文章将介绍一些最新的方法，帮助你高效制备miRNA-Seq的文库。
miRNA，而非mRNA
QIAGEN NGS产品开发的副主管Jonathan Shaffer认为，目前的文库制备和PCR技术已经相当好，不需要特别富集小RNA（smRNA）。最关键的要求是RNA制备要干净，且没有肝素（这是一种相当强的RT抑制剂）。
需要注意的是，在提取RNA时应保留小RNA。加州大学戴维斯分校的Lutz Froenicke表示，修改标准的RNA提取方案，采用更高浓度的盐沉淀，可以确保小RNA被回收。对于那些倾向于试剂盒的研究人员，他建议使用Zymo Research的产品，因为它们\"价格便宜效果好”。如果起始量低，他建议使用Norgen Biotek的试剂盒。
mRNA的文库制备通常是从片段化开始的，然后通过随机引物法来产生cDNA。不过，miRNA非常小，也就不需要片段化。\"如果你使用随机引物，那么合成将从分子中间的某个地方开始，漏掉了大约10个碱基，”Froenicke解释说。因此，miRNA的文库制备是直接在RNA上连接3’和5’接头，同时创建模板，让引物可以结合。
讨厌的接头二聚体
然而，这种接头连接的策略也带来了一些棘手问题。3’和5’接头可能彼此连接，形成二聚体。二聚体过多的话则占据了宝贵的测序资源，使得较低丰度的物种无法测序，甚至造成整个运行损失。Takara Bio USA的科学家Marta Gonzalez-Hernandez表示：\"仪器需要一个非常多样化的文库，以确保它们能够区分各个簇，并为你提供正确的序列，而接头二聚体始终是相同的序列。”
人们意识到这个问题，并采用一些策略来防止或去除引物二聚体。最显而易见的方法就是大小选择（size selection），这也可以作为纯化步骤来去除其他污染。大小选择至少可通过三种方式完成。康奈尔大学的副教授Praveen Sethupathy认为，凝胶电泳再加上手动切胶是传统的方法，但\"相当费力，特别是在制备大量样本时”。
Sage Science的Pippin Prep自动化DNA大小选择系统\"效果非常好，但成本至少是两万美元” ，因此你只能在一些核心实验室见到它，Froenicke谈道。第三种方法是基于磁珠的选择。这种方法的分辨率不大足以区分接头二聚体和带插入片段的文库，但快速方便，因此一些试剂盒会推荐。
一些试剂盒则另辟蹊径，阻止接头二聚体的形成。有的在添加5’接头之前，去除过量的3’接头。有的则利用化学修饰的接头，阻断二聚体的形成。比如QIAGEN的QIAseq miRNA Library Kit，它利用修饰寡核苷酸的专利方法几乎避免了测序文库中接头二聚体的存在，有效去除了测序过程中经常观察到的主要污染物。
另外一个选择是一开始不连接接头。Takara和Diagenode的试剂盒是利用聚腺苷酸化、逆转录、模板转换以及PCR的组合来创建带有条形码接头的RNA-Seq文库。这些策略旨在减少接头连接的偏倚，这个问题已逐渐被人们意识到。
如何避免偏倚
另一种减少偏倚的方法就是像Bioo Scientific的NEXTflex Small RNA Sequencing Kit那样，使用接头库。这些接头或多或少带有相同的序列，但在末端的连接发生处使用随机的碱基。据介绍，这个试剂盒所产生的文库与qPCR的相关性非常好。
QIAGEN的试剂盒则整合了特异性分子条形码（UMI）。区别于传统的数据分析方法，通过对于测序结果中分析条形码种类而非数量的统计，避免了扩增过程中因扩增效率而引入的偏倚，让miRNA-Seq定量分析的灵敏度可媲美qPCR。
当然，研究人员感兴趣的也许不止是miRNA。目前已发现有其他种类的小分子RNA，也发挥重要的生物学作用。在研究这些小RNA时，你首先需要了解试剂盒的原理是否与感兴趣的RNA相匹配。比如，许多小RNA带有修饰碱基或保护帽，这就为连接操作带来了一些挑战。不过，相信这可难不倒你们。
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（作者：Josh P. Roberts / 生物通编译，略有修改）
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