免疫荧光利用纳米抗体和抗体增强您的 IP 和 IF 实验利用纳米抗体和抗体增强您的 IP 和 IF 实验

利用纳米抗体和抗体增强您的 IP 和 IF 实验

 

视频转录

大家好。欢迎参加我们关于增强纳米抗体和抗体免疫沉淀和免疫荧光实验的技术讲座。本次演讲将由 Chromotek 产品经理 Astrid Sitte 博士和 Proteintech Europe 技术专家 Rebecca Northeast 博士主讲。

Proteintech 简介

因此，我们首先简要介绍一下公司。在Proteintech，我们是最初的制造商自 2002 年以来，我们一直致力于抗体、ELISA 试剂盒和蛋白质的生产。我们最近获得了 ISO 认证，这意味着我们可以生产用于细胞和基因治疗的 GMP 级细胞因子和生长因子。 Proteintech 拥有针对 13,000 个靶标的多克隆和单克隆抗体。其中，针对两个半千个靶标的抗体已通过敲除验证验证了其特异性。今年，我们推出了用于直接免疫荧光的 CoraLite 荧光染料抗体和用于蛋白质检测的蛋白质药物。

Proteintech 和 Proteintech 之间的主要区别与抗体供应商不同的是，我们的每一个产品都是我们自己生产的，而且您只能购买带有我们标签的产品。通过消除中间商并不允许其他任何人以其标签销售我们的产品，我们为您提供完全的透明度。这意味着批次间的一致性更高，因为除了直接来自实验室的庞大原始验证数据库之外，IT 还可以保证供应，并对我们的抗体进行全面的质量控制，确保它在您手中发挥作用。作为一家公司，我们通过您的科学成功来衡量我们的科学成功，特别是帮助您更快地发表有影响力的研究成果。该图显示，在我们公司的历史上，我们的产品每年都会出现在越来越多的出版物中。截至今天，我们的出版物引用次数已超过 70,000 次。 Chromotek 于 2020 年成为 Proteintech 集团的一部分。Chromotek 的使命是通过基于高性能纳米抗体的试剂为蛋白质组学和细胞生物学领域的非凡发现提供支持；努力改进、加速和简化全球研究ld。他们拥有超过 15 种独特的产品，被引用次数超过二千次。今天，Astrid Sitte 博士将展示免疫沉淀幻灯片，我本人 Rebecca Northeast 将展示免疫荧光。

第 1 部分：免疫沉淀通用实验方案

欢迎大家参加今天关于抗体和纳米抗体在免疫沉淀和免疫荧光中的应用的演讲。我的名字是 Astrid，我想从第一部分开始，免疫沉淀或简称 IP。免疫沉淀是一种使用抗体从蛋白质提取物中分离出目标蛋白质的技术。您在这里看到三个主要步骤。第一步是绑定步骤；您感兴趣的蛋白质与抗体和珠子结合的步骤。第二步，未结合的蛋白质被洗掉。然后最后一步，您感兴趣的蛋白质从抗体中洗脱下来。您在这里看到了一般方案，首先包括裂解液ep 或细胞验证的制备，然后进行预清除。然后是额外的 IP、结合和清洗步骤。最后，通过 SDS-PAGE 或蛋白质印迹洗脱和分析您感兴趣的蛋白质。影响免疫沉淀结果的因素有很多，例如基质的选择和结合蛋白的选择。另外，在细胞裂解步骤中如何处理蛋白质。您还可以优化抗体结合、清洗和洗脱步骤。我现在想和您一起完成所有步骤。让我们首先比较可用的不同矩阵。常见的珠子类型有琼脂糖、磁性琼脂糖和磁性颗粒M-270三种，它们的规格各不相同。琼脂糖珠和磁性琼脂糖珠是多孔的，而磁性颗粒 M-270 由实心核组成。结合能力也不同。琼脂糖和磁性琼脂糖的含量很高，磁性颗粒 M-270 的 d 较低。琼脂糖珠的分离只需通过离心即可完成，而您可以使用磁性琼脂糖和磁性颗粒 M-270 的磁铁。

取决于您使用的抗体数字沉淀，你还得考虑蛋白质。因此，用于动员的蛋白质 A 或 G，有一个明显的偏好。例如，小鼠 IgG2a 抗体可以结合蛋白 A 或同时结合蛋白 G。而小鼠 IgG1 抗体只能很好地结合蛋白 G。因此，如果您根据抗体的种类和亚类提前检查您需要哪种类型的蛋白质，那就太好了。此外，您还可以更改抗体的动员策略。最常见的策略是简单地将抗体与 Protein A 或 G 珠一起孵育，然后发生非共价相互作用。如果您需要更稳定的相互作用，您可以添加额外的交联步骤，这样就不会影响有效地交联抗体蛋白 G 珠。当您通过共价相互作用将抗体直接缀合到珠子上时，可以达到最高的稳定性。现在进入裂解液步骤。因此，根据您感兴趣的蛋白质，您通常可以尝试使用细胞裂解液缓冲液的缓冲液成分。适用于大多数细胞质蛋白的标准裂解缓冲液由带有一些氯化钠和洗涤剂的 tris 缓冲液组成。当您处理核蛋白时，您可以使用 RIPA 缓冲液，并且根据您感兴趣的蛋白质，您还应该向裂解液缓冲液中添加其他补充剂，例如蛋白酶抑制剂或 DNAase。如果您正在研究膜蛋白，您可能会考虑使用更高浓度的去污剂。例如，有些蛋白质还需要还原剂。

故障排除/注意事项

在这张幻灯片上，现在介绍了抗体结合的一些注意事项泰普。重要的是不要将目标蛋白孵育太久。通常，孵育一小时就足够了，否则，您只会增加细胞蛋白质的结合 - 因此细胞蛋白质的非特异性结合。混合也应该温和。将珠子保持在溶液中很重要，但通常缓慢旋转就足够了。至于体积，当您使用 1.5 毫升试管时，建议体积范围为 200 至 500 微升。如果您的体积较小，则无法确保正确混合，而当您的体积较大时，则您会过度稀释样品。为了让您的蛋白质保持满意，您还应该尝试尽可能温和地对待它，并在四度下工作，并使用温和的缓冲液。现在进行洗涤步骤时，您可以使用更刺激的缓冲液，因为您想去除所有您不感兴趣的细胞蛋白质。因此，您将使用更高浓度的洗涤剂比结合缓冲液或更高的盐浓度。由于条件较为恶劣，您应尽量缩短洗涤步骤。因此，只需混合几分钟，并重复三到五次即可。这通常就足够了。并且尽量将体积保持在 1 到 1.5 毫升的范围内。例如，如果您使用较大的体积，则可能会丢失一点您感兴趣的蛋白质。现在对于最后一步，对于洗脱步骤，有三种不同的选项可用。常见的一种是酸性洗脱，例如使用 200 毫摩尔的甘氨酸缓冲液。这种低 pH 缓冲液会破坏抗体和目标蛋白质之间的相互作用，但由于 pH 值较低，因此在洗脱步骤后立即中和非常重要。当您使用标签蛋白质时，当您有带有标签的感兴趣蛋白质时，您还可以考虑蛋白水解错觉。因此，您需要一个切割位点在您感兴趣的蛋白质和标签值之间。当您的目标蛋白仍与抗体结合并且洗脱液中的珠子含有您感兴趣的天然蛋白酶时，只需将其孵育即可，但之后您还必须去除蛋白酶。最后一种可能是最流行的洗脱选项是使用 SDS 样品缓冲液并将样品煮沸几分钟，这样您就可以使抗体和感兴趣的蛋白质变性，并且您的样品就可以在 SDS-PAGE 或通过蛋白质印迹法。

抗体和纳米抗体

现在，当您在处理内源蛋白质时正确选择实验中使用的工具时，我们建议您使用用于免疫沉淀的抗体。 Proteintech 拥有超过 4,000 个经过验证的 IP 靶点和 13,000 个经过验证的蛋白质印迹靶点。然后有 2,500 个目标已被验证并敲除或敲除样本s。因此，Proteintech 不仅为免疫沉淀提供了合适的工具，还为随后的蛋白质印迹分析提供了合适的工具。右侧显示的是我们流行的针对 ZO-1 蛋白的抗体之一，ZO-1 是一种紧密连接蛋白和细胞极性标记。您可以看到该蛋白质与抗体很好地沉淀。之后也可以使用相同的抗生素进行蛋白质印迹分析。

当您不使用内源蛋白，但当您的目标蛋白在带有附加标签的细胞中过表达时，您也可以考虑使用纳米抗体免疫沉淀。以下是关于纳米抗体的简短摘要：我想你们都熟悉由骆驼科动物（如羊驼或美洲驼）的重链和轻链组成的传统抗体，例如，它们还有一种特殊类型的抗体，仅由 t 组成重链，它们被称为重链抗体。纳米抗体在这里显示为绿色，它实际上是重链抗体的结合域。这种纳米抗体的尺寸只有15千道尔顿，比抗体小得多，可以直接与抗体偶联进行免疫沉淀，称为纳米陷阱。

免疫沉淀中的纳米抗体的特点是你在 SDS-PAGE 上没有抗体重链和轻链，因为你只有一个 15 千道尔顿的小纳米抗体，它与珠子共价连接，纳米抗体可以与其靶标有非常高的亲和力。例如，我们的 GFP n任何抗体与其目标 GFP 的亲和力均为 1 皮摩尔。纳米抗体很小，它们与珠子共价连接，因此您可以使用严厉的清洗，首先清洗它们以去除全细胞蛋白质，并且由于共价连接，它可以立即使用。 Nano-Trap 可用于常见标签，如 GFP、mCherry，也可用于小肽标签，如 Myc 或 V5 标签、斑点标签，以及 Halo 或 SNAP/CLIP 标签等标签。 Nano-Trap 产品线已在 2000 多篇出版物中被引用。接下来，我想将时间交给我的同事 Rebecca，她现在向大家介绍免疫荧光部分。

第 2 部分：免疫荧光简介

谢谢阿斯特丽德。我叫 Rebecca Northeast，今天我将接手演讲的后半部分，与大家谈论免疫荧光。首先介绍免疫荧光中的术语和常用的字谜。免疫只是指结合蛋白g针对抗原的抗体。免疫组织化学是组织内的抗原检测，免疫细胞化学是细胞内的抗原检测。免疫荧光背后的基本前提是抗体与样品中所需的抗原结合，然后添加二抗，该二抗与一抗结合。这种二抗含有荧光团，它会在激发时发出一定波长的光。 IF 允许多重相互作用，因此您可以对多种蛋白质进行成像，前提是您的一抗是在不同宿主中产生的或具有不同的 IgG 亚类，因此它可以被适当的二抗选择性地靶向。 IF 的整体协议相对简单。首先是固定，然后是细胞间靶标的透化，然后是封闭步骤以尽量减少非特异性结合，然后是抗体孵育，然后进行安装和分析。足够的洗涤步骤必须这样做是为了确保去除任何未结合的抗体并减少背景信号。我们拥有适用于所有抗体的产品特定方案，其中详细介绍了我们在内部验证中发现最适合我们的最佳外观条件以及扩张和孵育。

实验方案优化

在开始免疫荧光实验之前，您首先需要考虑样品制备以获得最佳结果。将细胞固定在玻璃盖组支架上，此时其汇合度应约为 50%，以产生最佳染色效果。如果这个值太高，那么你会得到变形的细胞结构和高背景。如果这个值太低，那么你会得到不正确的细胞图案。应将组织切成厚度约为 5 至 10 微米的部分。如果太厚，您会得到更强的信号，但也会得到较差的分辨率和较高的背景。如果太薄，那么您的样品可能是容易损坏，嵌入困难。组织和细胞在染色前需要固定，以防止结构崩溃。如果您在免疫荧光染色方面遇到问题，那么改变固定类型可能会产生巨大的有益效果和结果。多聚甲醛的作用本质上是通过产生共价交联将蛋白质拉在一起形成不溶性网络。乙醇或丙酮等有机溶剂固定剂的作用是使细胞脱水，导致蛋白质原位沉淀。乙醇和丙酮是好的，因为它们可以保护细胞结构，但是它们会对某些表位造成损害并导致脂质成分的损失。

通过交联固定器固定后，必须对细胞进行透化处理，以便抗体到达细胞内靶标。如果您想针对内部膜，例如细胞核或细胞器，则必须使用强非离子洗涤剂，例如 Triton-X。如果哟您只关注细胞质目标，而洋地黄皂苷等温和的去污剂对此也有好处。 SDS 是另一种细胞透化剂，它通过部分变性交联并揭示难以接近的表位来发挥作用。请记住，如果使用有机溶剂作为固定剂，则不需要透化，因为有机溶剂的性质意味着细胞质膜已经被破坏。

抗体

选择一抗时，您需要决定是使用多克隆抗体还是单克隆抗体。一般来说，多克隆抗体更传统地用于 IHC。这是因为多克隆抗体是针对整个蛋白质抗原而产生的，因此具有针对不同表位的多个 IgG，并且具有高亲和力。单克隆抗体只有一个表位，具有很高的特异性并且交叉反应的可能性较小。如果您的抗原非常丰富，那么单克隆抗体是最好的。瓦当尝试新的抗体时，我们建议您进行滴定实验，通过改变其他抗体的扩张和孵育来确定最佳的信噪比。购买新抗体时，需要注意的是被引用的次数，以及您希望在其中使用该抗体的应用中从制造商处轻松获得的验证数据。选择二抗时，请注意您的宿主物种一抗，确保它能正确标记您的一抗。小鼠单克隆抗体也可以有不同的 IgG 亚类。为了确保您的二抗能够识别这一点，它需要是 IgG、重特异性和轻特异性。或者，如果小鼠单克隆抗体具有不同的同位素（例如 IgG1 或 IgG2a）以及不相关的同位素特异性二抗，则可以对其进行多重处理。复用时，确保这些光谱轮廓不重叠。在选择荧光团时，请注意不同的特性，例如，合成染料与合成染料。 FITC 等传统染料亮度较低且光稳定性较差。使用共焦时，合成染料（例如 Alexa 和 Coralite）是最好的，因为它们不太容易光漂白。

Chromotek 有纳米二抗系列。这些是抗 IgG 纳米抗体，具有亚类特异性并带有 Alexa 荧光标记。它们是重组生产的，用于 IF、WB。纳米二抗具有在同一步骤中孵育一抗和二抗的一步染色方案。与该抗体具有高亲和力结合。没有背景，也没有交叉反应，并且具有令人难以置信的高分辨率。当使用传统抗体进行 IF 时，您可以采取直接或间接的方法。直接涉及一抗直接与荧光团缀合，从而获得更清晰的信号和更低的背景。您不具有多个标记的二抗与一个一抗结合的信号放大效应。如前所述，直接有利于背景较少的较短协议，但是，不建议用于较低丰度的目标，并且还限制了多重设计的灵活性。

在 Proteintech，我们最近推出了一系列新的流行单克隆抗体，直接与我们的 CoraLite 荧光团结合。

故障排除

现在继续解决一些常见的故障排除问题，从信号缺失或信号差开始。如果您没有信号或信号差，您首先需要使用我们载玻片的阳性对照样本检查您的显微镜是否正常工作。另一件要检查的事情是你是否使用为您的荧光团选择正确的滤光片。失去活性的另一个原因可能是您的抗体失去了活性。因此，要么使用新批次，要么检查您的抗体是否按照制造商的说明正确存储。信号差也可能是由于过度固定等原因导致表位受损所致。可能有必要执行抗原修复步骤，尤其是在查看以前固定的组织时。非特异性结合或高背景可能是由于核靶标的透化不良造成的。也可能是由于抗体浓度过高造成的。因此，请进行试验滴定以优化抗体孵育。在右侧，我们可以看到抗网格蛋白抗体。当您以百分之一的较高浓度使用它时，实际上会出现背景染色，而在五百分之一的浓度下您可以看到清晰的染色。高背景也可能是由于样品洗涤和干燥不足造成的，这可能是由于得到缓解意味着增加洗涤的次数和时间。自发荧光是一个常见问题，尤其是在固定组织中。始终包含内源染色对照，从而从缓冲液中省略一抗和二抗，然后像平常一样执行其他所有操作。这将有助于评估样品中的自发荧光水平。自发荧光是由于某些氨基酸与甲醛的交联固定而产生的，具有荧光特性。甚至在红细胞中也同样强烈地寻址。大多数自发荧光位于绿色光谱中。正如您在这张未染色的人类 FFPE 肾脏样本图像中所看到的，绿色滤光片比红色滤光片具有更明显的生物标志物。因此，解决这个问题的一种方法是使用红色/远红荧光团，例如 CoraLite 594 和 CoralLite 647。您还应该在所需的最短时间内修复样品，并用 PBS 灌注组织以去除任何红细胞，并且t他具有强烈的荧光分子血红素。还可以使用 TrueView 等商业试剂，它非常适合减少所有来源的自发荧光。非常感谢您的聆听。

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