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实验方法原理 | 树突状细胞(DC)是一组分布广泛的、由骨髓来源的、具有迁移能力的免疫细胞。体外培养的细胞分化能力并为完全丧失,只是环境的改变。 |
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实验材料 | 血细胞淋巴细胞 |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | 筛网96孔培养板手术器械二氧化碳培养箱超净工作台液体闪烁仪多头细胞取集器49型玻璃纤维滤纸 |
实验步骤 | 1.外周血单个核细胞的采集 (1)用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100ml; (2)淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。 (3)无血清培养液洗涤2次,获得纯度在90%以上的PBMC,细胞数量需达到1-3x10e8 2.肿瘤抗原的制备 (1)手术切除肿瘤标本,无菌条件下,将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净; (2)无菌生理盐水洗3次; (3)用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎,加入RPMI1640培养基,充分研磨; (4)200目无菌网过滤后收集单细胞悬液; (5)用RPMI1640培养基重悬细胞至1-2x107/ml,装入5ml无菌冻存管中; (6)将冻存管浸入液氮中速冻,10min后取出,再迅速放入37oC水浴中解冻10min。反复3-5次;(注:也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。) (7)将肿瘤裂解物加入离心管中,3000rpm,离心10min; (8)收集上清,0.22?m滤膜过滤除菌,留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体; (9)-80oC保存备用。 3.DC细胞的培养 (1)步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2x106/ml,置于培养瓶内; (2)37℃,5%CO2培养箱中孵育2h,以使单核细胞贴壁; (3)洗去悬浮细胞,在贴壁细胞中加入含重组人GM-CSF(500-1,000U/ml)和重组人IL-4(500U/ml)的无血清培养液,37℃,5%CO2培养箱中培养,诱导单核细胞向DC细胞分化; (4)每2-3d半量换液一次,并补足细胞因子; (5)(可选步骤)在培养的第5d,加入步骤2中获得的肿瘤抗原50??g/ml,对DC进行抗原负载;(注:若不对DC进行抗原负载,该步省略。) (6)在培养的第6d,加入重组人TNF-?(10ng/ml),IL-1?(10ng/ml),IL-6(1000U/ml)和PGE2(1?g/ml),诱导DC细胞成熟; (7)在培养的第7d或第8d,收获DC细胞,其数量应达到1×106个以上; (8)DC的质检: ①活细胞比例:台盼蓝染色验证活细胞应在90%以上; ②形态学观察:>90%细胞半悬浮,细胞有多个树突样突起; |
注意事项 | 1.DC来源广泛,对实验的结果影响很大,来源包括,外周血单核细胞(Monocyte)、脐带血CD34+细胞、骨髓和胎肝等,但因外周血单核细胞最容易获取、数量也最多,所以临床上被广泛用作DC的来源细胞。 2.DC的成熟度两种,即iDC和mDC,而DC的抗原递呈能力与其成熟状态密切相关。iDC的抗原摄取和加工能力较强,但抗原递呈能力很弱。在体外培养时,iDC去除细胞因子(即GM-CSF和IL-4)后,会逆转为巨噬细胞,且即使在细胞因子的维持下,未成熟DC的功能也不是激活T细胞,而是抑制T细胞的增殖。mDC则正好相反,其抗原摄取和加工能力很弱,但具有很强的抗原递呈能力。因而可以激活T细胞,引起免疫反应。而且DC成熟后即使在培养体系中去除细胞因子,仍能保持DC的状态和功能,不会发生逆转。因此可以看出,DC必须完全成熟后才能用于免疫治疗。 3.树突细胞的观察:树突细胞的观察需要借助透射电镜,透射电镜可见DCs伸展的突起,扫描电镜还可以拍摄到DC正在捕捉凋亡小体。 |
其他 | 1.从DC的祖细胞(如单核细胞)诱导分化为未成熟DC:IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长,从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4,单核细胞将分化为巨噬细胞。同时,IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。 2.从iDC诱导分化为成熟DC:TNF-,IL-1和IL-6均为促炎症因子,在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。体外研究表明,这3种细胞因子均可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达,使细胞内MHCII类分子区室(classIIcompartment)消失,但能够上调细胞表面MHCI类、II类分子和B7家族分子(CD80,CD86等)的表达,使未成熟DC分化为成熟DC,此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱,而抗原递呈能力显著增强,可极强地激活T细胞。TNF-IL-1IL-6三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导DC的完全成熟,从而制备出可以应用于临床的DC。 3.树突细胞的提呈抗原的方法主要有①抗原多肽刺激的DCs②酸提抗原刺激的DCs③肿瘤抗原编码基因导入DCs④肿瘤mRNA刺激的DCs⑤细胞因子基因修饰DCs及其与肿瘤细胞融合。 |